毛蚶血细胞分类及吞噬功能研究

韩卓然，孙敬锋，通信作者，刘军锋，郭永军，邢克智，吕爱军，YEONG Yiksung，尤宏争



毛蚶血细胞分类及吞噬功能研究

韩卓然1，孙敬锋1，通信作者，刘军锋2，郭永军1，邢克智1，吕爱军1，YEONG Yiksung1，尤宏争3

（1. 天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；2. 天津市渔生堂生物技术有限公司，天津300404；3. 天津市水产研究所，天津 300221）

通过光镜观察毛蚶血细胞形态和结构，对其分类进行研究，分析不同类型血细胞吞噬能力，并研究温度对血细胞吞噬功能的影响。结果鉴定出毛蚶血细胞中有3种类型：（1）大透明细胞，大小为（12.97±1.22）µm，核质比为0.311±0.016，所占比例为（46.40±8.73）%；（2）颗粒细胞，大小为（9.98±1.85）µm，核质比0.390±0.058，所占比例为（41.48±8.63）%；（3）小透明细胞，大小为（7.60±1.17）µm，核质比为0.499±0.049，所占比例为（12.12±4.00）%。毛蚶血细胞在血淋巴液中的平均密度为（7.69±0.98）×106cell/mL。体外吞噬活性试验表明，大透明细胞和颗粒细胞对酵母聚糖的吞噬率显著高于小透明细胞，吞噬率分别为（61.77±3.30）%、（61.32±3.62）%、（16.59±3.88）%。于15、20、25、30、35 ℃温度下进行毛蚶血细胞的吞噬试验，结果表明温度变化对血细胞吞噬能力产生明显的影响，30 ℃条件下，血细胞的吞噬活性最强，吞噬率达到（51.49±4.22）%。

毛蚶；血细胞；分类；吞噬功能

贝类属于低等无脊椎动物，不具有依赖淋巴细胞和抗体的获得性免疫防御机制。血细胞是贝类抵御外来微生物侵袭的主要承担者。贝类血细胞的吞噬作用是一种基本的原始防御机制，对贝类的免疫防御具有更为重要的意义。近年来，学者们对贝类血细胞的分类已有不少研究，目前，细胞形态结构、核质比、免疫功能特点常常被用作贝类血细胞分类的重要依据[1]。但由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，难以获得统一的标准，所以造成了贝类血细胞分类上的复杂化，目前不同研究者的观点存在很大分歧。

毛蚶（Lischke）属软体动物门，瓣鳃纲，蚶目，蚶科，毛蚶属。在已有的毛蚶血细胞分类研究中，报道的结果目前并不统一。刘志鸿[2]通过形态学观察，认为毛蚶血细胞可分为红细胞、透明细胞、颗粒细胞和未知小细胞4个亚群。许秀芹等[3]利用流式细胞术分析毛蚶血细胞的侧向角散射光信号和前向角散射光信号特征，认为可分为颗粒细胞和透明细胞2个亚群。本文以毛蚶血细胞形态结构特征为基础进行分类，首次分析不同类型血细胞的核质比和吞噬能力，并研究温度对血细胞吞噬功能的影响，以期为毛蚶血细胞的亚群鉴定及免疫功能深入研究提供新的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

健康毛蚶（壳高30.0～42.0 mm；壳宽28.0～40.0 mm；壳长34.5～56.0 mm）购自天津市某水产批发市场，于实验室暂养5 d，水温20～25 ℃，每天换水一次。

1.2 血细胞分类和形态观察

选取40只健康毛蚶，撬开贝壳，滤纸吸收水分后，用1 mL注射器从每只毛蚶闭壳肌血窦中抽出血淋巴液0.1～0.3 mL，加入到装有等量Alsever抗凝剂[4]的Eppendorf（EP） 管中，然后将每个个体的血淋巴液混合均匀后分装到EP管中。采用Neubauer氏血球计数板对血细胞进行活体观察和计数。用瑞氏染液染色血细胞涂片，光学显微镜40×物镜下观察血细胞形态和结构，计算不同类型血细胞的比例，在3张染色的涂片上，随机测量25个不同类型血细胞的细胞核和细胞直径，计算核质比。

1.3 不同类型血细胞的吞噬活性

根据Bachère等[5]的方法制备酵母聚糖（Sigma公司）悬液。用PBS配制7 mg/mL浓度的酵母聚糖悬液，煮沸30 min，洗涤2次，最后悬浮在相同体积的PBS中，于-20 ℃保存备用。血淋巴液经过180 g，5 min，4 ℃条件下离心，收集血细胞，用PBS调整血细胞悬液浓度为1×106cells/mL。在血细胞悬液中加入酵母聚糖混匀，使酵母聚糖与血细胞数量的比例大约为5∶1，然后在室温孵育60 min。吞噬试验设置3个重复。随机选取20个视野在油镜下观察，分别计算不同类型血细胞吞噬率。

吞噬率＝（有吞噬活性的血细胞数/被计数血细胞总数）×100％

1.4 不同温度下的血细胞吞噬活性

于15、20、25、30、35 ℃温度下进行毛蚶血细胞的吞噬试验，每个温度下设置3个重复。按1.3所述方法进行试验，并计算吞噬率。

1.5 统计方法

应用SPSS统计软件，方差分析和检验比较不同类型血细胞大小、细胞核大小、核质比、吞噬率之间的差异显著性，Duncan检验比较在不同温度下血细胞吞噬率的差异显著性。数据用平均值±标准差（）表示，＜0.05代表具有显著性差异。

2 结果

2.1 血细胞形态学特征及分类

在瑞氏染色的血涂片上，根据形态特征不同，可以鉴定出毛蚶血细胞中有大透明细胞、颗粒细胞和小透明细胞3种类型（图1：A，B，C，D）。除3种类型血细胞外，在涂片中还可观察到少量血细胞由于受到理化因素作用导致胞浆崩解溶失之后残留的细胞核（图1：C，D）。表1显示3种类型血细胞大小、细胞核大小和核质比。统计分析表明细胞直径、细胞核直径和核质比在3种类型血细胞之间都存在显著性差异。

大透明细胞：细胞大多数呈卵圆形，体积最大，直径在10.5～14.9 µm之间。细胞质丰富，染色较淡，细胞质外周多有不规则透明区域；胞质内颗粒较少，在靠近细胞核区域有少量蓝紫色嗜碱性颗粒，偶尔能观察到嗜酸性红色颗粒。细胞核呈圆形，直径在3.4～4.7 µm之间，居中或靠近细胞一端，核质比最小，在0.29～0.35之间（图1：C；表1）。

颗粒细胞：细胞大多数呈圆形，细胞直径在6.8～12.6 µm之间，细胞质通常较稠密，染色较深，胞质中有大量大小不一的蓝紫色嗜碱性颗粒。细胞核呈圆形，直径在2.9～4.6 µm之间。大部分细胞的细胞核呈圆形，居中存在，核质比在0.32～0.52之间（图1：D；表1）。

小透明细胞：细胞大多数呈圆形，体积最小，细胞直径在5.9～9.6 µm之间。细胞质稀薄，染色较浅，胞浆内无颗粒或很少。细胞质内有一显著的细胞核占据细胞中央，核直径在2.8～4.7 µm之间，核质比最大，在0.42～0.57之间（图1：B；表1）。

图1 光镜下毛蚶3种类型血细胞

（注：A为10×物镜下3种类型血细胞；B为小透明细胞放大图片；C为大透明细胞放大图片；D为颗粒细胞放大图片。LH 示大透明细胞，SH示小透明细胞，G示颗粒细胞，粗箭头示残留的细胞核，黑色细箭头示蓝紫色嗜碱性颗粒，白色细箭头示红色嗜酸性颗粒）

表1 毛蚶不同类型血细胞的细胞大小、核大小和核质比（平均数±标准差）

毛蚶血细胞在血淋巴液中的平均密度为（7.69±0.98）×106cells/mL，其中大透明细胞、颗粒细胞、小透明细胞所占百分比分别为46.40±8.73、41.48±8.63、12.12±4.00。

2.2 不同类型血细胞的吞噬活性

光镜下观察显示，大透明细胞、颗粒细胞和小透明细胞都对酵母聚糖显示吞噬活性（图2）。大透明细胞吞噬率最高，其次是颗粒细胞和小透明细胞，吞噬率分别为（61.77±3.30）%、（61.32±3.62）%、（16.59±3.88）%。结果表明，大透明细胞与颗粒细胞的吞噬率较强，两者之间差异不显著。小透明细胞吞噬率最低，与其他两种类型血细胞比较，吞噬率具有显著性差异（图3）。

图2 毛蚶3种类型血细胞的吞噬活性

（注：LH示大透明细胞，SH示小透明细胞，G示颗粒细胞，细箭头示酵母聚糖颗粒，粗箭头示残留在玻片上的细胞核）

图3 毛蚶3种类型血细胞的吞噬率

（注：柱状图上方字母不同表示两者之间吞噬率具有显著性差异）

2.3 不同温度下的血细胞吞噬活性

分别在15、20、25、30、35 ℃温度条件下测定毛蚶血细胞吞噬活性。如图4所示，30 ℃条件下，血细胞的吞噬活性最强，依次是25 ℃、20 ℃、35 ℃和15 ℃，吞噬率分别为（51.49±4.22）%、（48.37±7.24）%、（42.37±2.85）%、（40.89±3.08）%、（34.87±2.99）%。统计分析结果表明，25 ℃和30 ℃时的吞噬率没有显著性差别，15 ℃时的吞噬率分别与25 ℃、30 ℃时的吞噬率具有显著性差别，35 ℃和30 ℃时的吞噬率也具有显著性差别。

图4 不同温度下毛蚶血细胞的吞噬率

（注：柱状图上方标注如有相同字母表明两者之间差异不显著）

3 讨论

目前普遍认为，蚶类血细胞中一些类群能够参与氧的运输。而且，已有研究从毛蚶血细胞裂解液中分离到血红蛋白[6]。因此，在蚶类血细胞中存在能够产生血红蛋白的红细胞亚群。Hartman等[7]认为，细胞形状与其气体交换能力有关，相同体积下，椭圆形的细胞比圆形细胞更利于氧的运输。本试验中观察到，大透明细胞大多呈椭圆形，笔者认为这种大透明细胞在功能上对应的是具有氧运输能力的红细胞，其细胞质外周有不规则透明区域可能与氧的运输过程有关。大透明细胞细胞质丰富，染色较淡，胞质内颗粒较少，在靠近细胞核区域有少量蓝紫色嗜碱性颗粒，偶尔能观察到嗜酸性红色颗粒。颗粒细胞胞质稠密，染色较深，胞质内颗粒较多，能够观察到大量大小不一的蓝紫色嗜碱性颗粒。根据张维翥等[8]的观点，嗜碱性颗粒多数为细胞吞噬的异物，嗜酸性颗粒反映了水解酶的特性。本研究中还观察到体积最小、核质比最大的透明细胞，其显著特点是一个突出的细胞核外围包裹一层薄的细胞质，这与大多数双壳贝类中发现的透明细胞类似。在蚶类血细胞分类中，刘志鸿[2]将毛蚶的血细胞分为红细胞、颗粒细胞、透明细胞、未知小细胞4种类型；许秀芹等[3]用流式细胞仪检出毛蚶具有颗粒细胞和透明细胞2个细胞类型；朱泽闻等[9]对泥蚶分为红色颗粒细胞、嗜碱性颗粒细胞和透明细胞3种类型。本研究通过光学显微镜观察毛蚶血细胞形态结构特征，将其分为3种不同类型，分别是大透明细胞、颗粒细胞、小透明细胞。这与刘志鸿[2]在毛蚶、朱泽闻等[9]在泥蚶中的研究结果基本一致。从形态上看，本研究中报道的毛蚶红细胞比刘志鸿[2]报道的要小，而其他类型则相对大一些。目前人们对贝类血细胞的发生、多态性等方面了解的还很少，导致对贝类血细胞各亚型的划分具有很大的人为性。在试验过程中，血细胞预处理条件的不同可能会影响细胞的大小和形态，而且贝类年龄的差异或者血细胞处于不同发育阶段也可能导致报道的毛蚶不同类型血细胞大小存在差异。

贝类血细胞的数量可能因种类不同而存在较大差异。即使同一种类也可能因不同的年龄、生理状态、环境协迫和不同的研究方法而出现差异[10]。本试验中，毛蚶血细胞计数为（7.69±0.98）×106cell/mL。与已报道的泥蚶[9]（3.29±0.82）×106cell/mL、栉孔扇贝[11]（3.03±0.11）×106cell/mL、杂色鲍[12]（1.52±0.5）×106cell/mL等数据都有比较大的差别。在毛蚶中，大透明细胞所占比例最高，其次是颗粒细胞和小透明细胞。这与朱泽闻等[9]对泥蚶的研究结果基本一致。

吞噬作用是血细胞免疫防御相关的重要功能之一。本试验结果表明，毛蚶不同类型血细胞都具有吞噬活性，但颗粒细胞与大透明细胞的吞噬活性较强。嗜碱性颗粒在大透明细胞和颗粒细胞中都有存在，可能与这两种细胞具有较强的吞噬活性有关。贝类中颗粒细胞的吞噬作用已得到广泛认同，如在近江牡蛎[13]、栉孔扇贝[14]、泥蚶[9]等都报道了颗粒细胞的吞噬活性。在毛蚶大透明细胞中有少量的嗜碱性颗粒，偶尔能观察到嗜酸性颗粒，在功能上除了具有运输氧的能力外，还具有较强的吞噬活性。这是由于贝类免疫系统不完善，大透明细胞已经分化出通常红细胞具有的携氧功能，但还需保留吞噬功能发挥抗菌作用[15]。

毛蚶血细胞的体外吞噬活性与温度有明显的相关性。在15 ℃条件下吞噬率最低；随温度升高，吞噬率逐渐增高，30 ℃时吞噬率最高；35 ℃时又有所降低。试验结果与Fisher[16]关于牡蛎血细胞吞噬率随温度变化的研究结果基本一致。这种影响与温度对贝类生长及生活状态的影响规律一致。所以，可以参考不同温度下吞噬活性来摸索贝类的最佳生长温度条件。

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[3] 许秀芹，王宜艳，孙虎山. 流式细胞术比较研究4种双壳贝类血细胞的分群[J]. 海洋湖沼通报，2006（1）：46－50.

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责任编辑：张爱婷

Studies on Hemocytes Types and their Phagocytic Ability in

HAN Zhuo-ran1, SUN Jing-feng1, Corresponding Author, LIU Jun-feng2, GUO Yong-jun1, XING Ke-zhi1, LÜ Ai-jun1, YEONG Yiksung1, YOU Hong-zheng3

（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Yushengtang Biotechnology Co. Ltd., Tianjin 300404, China; 3.Tianjin Fisheries Research Institute, Tianjin 300221, China）

Light microscopical studies were carried out to characterize the hemocytes of. According to the size, shape, and some structural characteristics of the cells, three types of hemocytes were identified：（1）Large hyalinocytes, with a size of（12.97±1.22）µm, N/C ratio of 0.311±0.016, and percentage of（46.40±8.73）%;（2）Granulocytes, with a size of（9.98±1.85）µm, N/C ratio of 0.390±0.058 and percentage of（41.48±8.63）%;（3）Small hyalinocytes, with a size of （7.60±1.17）µm, N/C ratio of 0.499±0.049, and percentage of（12.12±4.00）%. The mean hemocytes concentration was about（7.69±0.98）×106cell/mL. Phagocytic response to the zymosan showed that the phagocytic rate of large hyalinocytes （61.77±3.30）%, and granulocytes（61.32±3.62）%was significantly higher than that of small hyalinocytes（16.59±3.88）%. The influence of temperature at 15, 20, 25, 30and 35 ℃ on hemocyte phagocytosis was studied and the results showed percentage of phagocytosing hemocytes was highest at 30 ℃, reaching to（51.49±4.22）%.

; hemocytes; classification; phagocytosis

1008-5394（2017）03-0050-05

S 917.4

A

2016-09-30

现代农业产业技术体系项目“国家贝类产业技术体系天津综合试验站”（CARS-48）；天津市水产产业技术体系创新团队项目“现代产业技术体系-水产-对虾病害岗位”（ITTFRS2017009）及“现代产业技术体系-水产-贝类养殖岗位”（ITTFRS2017013）；天津市科技计划项目“天津市海水养殖业健康发展战略研究”（16ZLZXZF00210）

韩卓然（1992-），女，天津市人，硕士在读，研究方向为水产动物免疫学。E-mail：hzr_0714@163.com。

孙敬锋（1976-），男，山东东平人，教授，博士，研究方向为水产动物免疫学。E-mail：sun_jf@163.com。