人工饲养条件下棕黑锦蛇肾脏形态异常的初步研究

程建鑫 姚晨昊 王珊珊 李丕鹏 陆宇燕

(沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳，110034)

人工饲养条件下棕黑锦蛇肾脏形态异常的初步研究

程建鑫 姚晨昊 王珊珊 李丕鹏*陆宇燕*

(沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳，110034)

在对人工养殖的棕黑锦蛇体质测量的研究中发现一例蛇肾脏出现形态异常后，应用大体解剖和组织学方法对其进行深入观察，并检测血液指标的变化。肾脏异常表现为2个肾脏形状和大小明显不同，其中左肾明显肥大，肾系数约为正常肾脏的2倍；而右肾则明显萎缩，肾系数仅为正常肾脏的1/6。组织活检表明，左肾实质组织结构基本正常，而右肾实质变得密集，肾单位之间增生有丰富的纤维性结缔组织。此外，2个肾均出现肾小体萎缩、碱性物质沉积等病变。在血液学检测中，肾病蛇的红细胞和血栓细胞数量低于正常蛇，且有显著性差异。19项血液生化指标中有9项与正常蛇有明显差异。观察结果表明左肾的肥大可能是对右肾萎缩的补偿，其组织结构的变化也可能是一定程度上的功能反应。血液学指标的变化是由于这种形态异常引起的生理功能变化所致，说明这条蛇处于疾病状态。尽管对这种肾脏异常的诱因尚不清楚，但应对蛇的饲养管理、食物和营养状态予以足够重视。

棕黑锦蛇；肾脏；形态异常；疾病；饲养管理

棕黑锦蛇(Elapheschrenckii)是中国北方常见的大型蛇种，并具有较高的营养价值，故有着大量的市场需求，近年来野外种群数量呈急剧下降的趋势[1-3]。为了保护野外种群，并部分满足市场需求，本实验室进行了棕黑锦蛇的人工养殖尝试。

本实验室在前期养殖中发现有一定数量的死亡现象，为了掌握棕黑锦蛇的一般生长发育规律和生理生化特征，对其进行了年周期的观察及检测，旨在建立棕黑锦蛇“健康档案 ”。此项工作的完成不仅可以丰富棕黑锦蛇的相关生物学基础资料，还可以为蛇病的提前诊断，预防治疗奠定理论基础。

肾脏是动物体内重要的排泄器官，具有排泄机体代谢废物、维持内环境中水、 电解质和酸碱平衡的作用[4-7]。对于爬行类而言，陆地环境对其体内水分调节能力有着更高的要求，然而当前对爬行类肾脏组织学研究的报道极为少见。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用棕黑锦蛇卵采自牡丹江，于2014年8月孵化出壳，在2015～2016年间，每月选取一定数量进食、活动正常的棕黑锦蛇进行解剖学观察，同时进行血液指标的检测。健康蛇的确定：进食和活动正常，解剖未见明显的器官病变，以其各项指标建立棕黑锦蛇生长发育和生理生化数据库。并将解剖中发现的有明显病变的蛇进行分类，并逐步进行报道。本次报道为2016年5月进行的实验观察，其中7条(雌雄兼用)为健康蛇，1条蛇(雌)有肾脏病变，本文称其为“肾病蛇”。

1.2 方法

将蘸有适量乙醚放入盛有棕黑锦蛇的干燥器中，待其停止活动后取出，固定于解剖板上，经泄殖腔上方纵剖其腹部至下颌部。心脏取血，利用BM21B半自动血细胞分析仪进行血细胞计数，利用上海安亭科学仪器厂(TGL-16G-C)高速台式冷冻离心机以8 000 r/min进行离心，吸取上清超低温保存，由沈阳艾迪康医学检验中心进行相关指标检测。利用哈尔滨量具厂GB/T14899—94数显游标卡尺对蛇体和肾脏进行测量，Mettler ToledoQ/OAFA02-2009电子天平进行称重。取部分肾脏以10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，厚7 μm，H-E及AB-PAS染色。奥林巴斯BX51-DP71显微镜观察和照相，利用Image-Pro Express 6.0软件进行测量，实验数据用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，相关数据以平均值±标准差表示。设置P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

1.3 相关计算方法

丰满度=躯体重(除去内脏后的胴体重，g)/体长(mm)；

肾脏相对长度=肾脏长(mm)/体长(mm)；

肾系数=肾脏重(g)/躯体重(g)。

2 结果

2.1 大体解剖与生物学量度

健康棕黑锦蛇肾脏(图1)颜色为暗红色，长条状。肾脏位于脊椎两侧，一般右侧肾脏略高于左侧，但左、右肾大小相近。肾脏表面可见大小基本一致的小结节连续排列，肾脏内侧有伴行的输尿管。

肾病蛇(图2)剖开腹腔后，可见左侧肾脏明显较健康蛇粗壮，颜色与健康蛇肾脏相似，在近肾脏的纵轴附近可见含有大量乳白色沉积物输尿管。右侧肾脏明显萎缩，外观颜色较左肾浅，肾脏不同区段粗细不一，小结节间联系不甚紧密。

由表1中数据可知，肾病蛇的体长和躯体重均略大于健康棕黑锦蛇，因此肾病蛇的丰满度大于正常蛇，前者是后者的117.24%，但无显著性差异。健康蛇的左、右肾脏4组数据中仅在肾的长宽比值上具有极显著性差异(P<0.01)，而在肾的相对长度、肾重和肾系数等3个数值上均呈右肾略大于左肾，但无显著性差异。肾病蛇仅在肾脏相对长度数值上表现为左、右肾较为接近，并与健康蛇肾脏的相对长度值的下限接近；肾病蛇的肾脏长宽比值右肾是左肾的715.31%，更是健康蛇左、右肾的808.63%和556.49%；肾病蛇的左肾重量及肾系数均近乎是右肾的 10倍之多，但其左右肾的总重量仅略大与健康蛇肾脏左、右肾的总重量(健康蛇肾总重量为5.24 g，肾病蛇肾总重量为5.696 g)，而左、右肾的总肾系数与健康蛇肾脏总肾系数几乎一致。

表1 棕黑锦蛇病变肾脏相关生物学量度

Tab.1 Biological measure of Elaphe schrenckii’s injured kidney

注：大写字母表示极显著差异性(P<0.01)

Note：Majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

2.2 肾脏组织学及相关测量

2.2.1 健康蛇肾脏

由图3可观察构成肾单位的各组成成分在切片中排列有序而紧密。肾小体呈圆形或近圆形(图4c)，多单独分布，偶有 2～4 个聚集在一起。肾小球表面细胞界限清晰，胞核中可见清晰的核仁。肾小囊腔界限清晰，在 AB-PAS 染色中其壁层细胞结构清晰，底面可见有薄层桃红色的基膜。近曲小管管壁由单层立方上皮细胞围成(图3 a)，细胞排列较紧密，胞质嗜酸性较强，胞质中可见较多的细小颗粒样物质，游离面有局部深染；胞核圆形，近细胞基底面分布，核仁清晰。在 AB-PAS 染色中可见近曲小管细胞的核上区有大量蓝色云雾状物质分布。远曲小管管壁由柱状上皮细胞围成(图3 b)，胞质嗜酸性，细胞游离面可见明显的刷状缘，胞核圆形，核仁明显，多分布于细胞近中部。在 AB-PAS染色中，管壁细胞有淡染和深染的区分，细胞游离缘深染(图4 d)。在近曲小管和远曲小管管壁细胞的基底面均有少量的呈长梭形的类肌细胞，其胞核清晰可见。

2.2.2 肾病蛇肾脏

左肾组织学结构基本正常，大部分区域肾小体和肾小管排列有序，在边缘区可见排列松散现象(图5～7)。肾小球呈现出明显的萎缩现象，且在其中出现大小不一的空泡(图5 e)，为细胞水样变性所致；一些肾小球严重萎缩，并在其边缘有较大的空泡存在，在其明显扩张的肾小囊腔中有大量嗜碱性沉积物(图8 f)；一些肾小球虽然无明显萎缩，但在肾小球和肾小囊内出现大量的嗜碱性沉积物(图9 g)。肾小管基本完整，仅个别有破裂现象及细胞基底部与基膜脱离(图10 h)，也有个别肾小管管壁细胞基膜呈现明显增厚。在管壁细胞核周(图10 i)或核下有明显的水样变性(图10 j)，也有个别管壁细胞分离的现象(图11 k)。在肾脏间质的小血管中也有大量嗜碱性沉积物的出现，但未见细胞成分，却有空泡存在(图11 l)。

图1 健康棕黑锦蛇肾脏解剖图；图2 肾病棕黑锦蛇肾脏解剖图；图3 健康棕黑锦蛇肾脏显微结构，H.E染色；图4 健康棕黑锦蛇肾脏显微结构，AB-PAS染色；图5～7 肾病棕黑锦蛇左肾脏显微结构，H.E染色；图8～11 肾病棕黑锦蛇左肾脏显微结构，AB-PAS染色；图12～13 肾病棕黑锦蛇右肾脏显微结构，H.E染色；图14～15 肾病棕黑锦蛇肾脏右肾显微结构，AB-PAS染色；a.健康蛇近曲小管；b.健康蛇远曲小管；c.健康蛇肾小体；d.细胞游离缘深染；e.肾小球萎缩及细胞水样变性；f.嗜碱性沉积物；g.嗜碱性沉积物；h.细胞破裂；i.细胞核周水样变性；j.细胞核下水样变性；k.管壁细胞分离；l.血管空泡；m.肾小球细胞水样变性；n.细胞水样变性；o.胶原纤维和平滑肌包裹的“小叶”；p.嗜碱性沉积物；q.细胞界限模糊；r.管腔丧失；s.嗜碱性沉积物重重包绕；t.嗜碱性沉积物重重包绕Fig.1 The kidney anatomy of healthy Elaphe schrenckiis；Fig.2 The kidney anatomy of illness Elaphes chrenckiis；Fig.3 The kidney microstructure of healthy Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.4 The kidney microstructure of healthy Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；Fig.5-7 The left kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.8-11 The left kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；Fig.12-13 The right kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.14-15 The right kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；a.Proximal convoluted tubule of healthy snake；b.Distal convoluted tubules of healthy snake；c.Renal corpuscle of healthy snake；d.The free edge hyperchromatic cells；e.Glomeruli shrink and cell hydropic degeneration；f.Basophilic deposits；g.Basophilic deposits；h.Cell rupture；i.The nucleus weeks hydropic degeneration；j.The nucleus of hydropic degeneration；k.The wall cell separation；l.Vascular cavity；m.Glomerular cell hydropic degeneration；n.Cell hydropic degeneration；o.Collagenous fiber and smooth muscle parcel orgenization structure；p.Basophilic deposits；q.The cell is blurred；r.Late lumen loss；s.Basophilic deposits circumvolutio；t.Basophilic deposits circumvolutio

右肾组织学结构在部分区域仍能辨认，但结构界限不甚清晰。肾小球大多数呈萎缩或者个别膨大，其间也存在大量水样病变现象(图12 m，图13 n)。而肾小管管径呈明显缩小，尤其是近曲小管，管壁出现塌陷，破裂和融合现象；管壁细胞内普遍出现水样病变。在右肾切片中可见大部分区域均出现了大量由间质(胶原纤维和平滑肌)包裹的“小叶”(图14 o)，其内有一定数量的基膜增厚而形成的“管状结构”，并可以辨别一系列的变化趋势(图15 p-t)：由于基膜增厚将肾小管包裹其中，管腔内有嗜碱性物质沉积；细胞界限模糊，管腔丧失；“管状结构”中胞核排列杂乱，并有逐渐收缩的现象；“管状结构”外周聚集大量嗜碱性沉积物将其重重包绕。

2.3 肾单位相关结构测量

由表2可见，肾病蛇肾脏左、右肾的肾小体面积均小于健康蛇肾脏的肾小体面积，分别是健康蛇肾脏的87.37%和59.44%，其中左肾肾小体与健康蛇肾脏之间无显著性差异，右肾与正常及左肾间均呈极显著性差异。

肾病蛇左、右肾的肾小球面积均小于健康蛇肾，左肾肾小球面积仅为健康蛇肾脏的59.45%，与之呈显著性差异；右肾肾小球面积仅为健康蛇肾脏的34.07%、左肾的57.3%，与两者间均呈极显著性差异。

肾病蛇左、右肾的肾小囊面积均大于健康蛇肾脏，分别是健康蛇肾小囊的169.93%和132.6%，与健康蛇分别呈极显著性差异和显著性差异，肾病蛇的左、右肾肾小囊面积呈显著性差异。

近曲小管：肾病蛇肾脏左、右肾近曲小管外径和上皮细胞高均明显低于健康蛇，且与其肾近曲小管外径和近曲小管上皮细胞高之间分别呈极显著性差异及显著性差异；而肾病蛇肾脏的左肾近曲小管外径和上皮细胞高数值均较右肾的大，左、右肾近曲小管管径呈极显著性差异，上皮细胞高呈显著性差异。

表2 肾单位相关结构测量

Tab.2 Measurement of structures related with nephron

注：小写字母表示显著差异(P<0.05)；大写字母表示极显著差异(P<0.01)

Note：Lowercase indicate significant correlations between data(P<0.05)；majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

远曲小管：肾病蛇左右肾的远曲小管管外径和上皮细胞高度数值极为接近，均无显著性差异；而与健康蛇肾脏比较在远曲小管上皮细胞高度上基本一致，无显著性差异；肾病蛇肾脏的远曲小管管仅为健康蛇肾脏的56.98%左右，两者之间呈极显著性差异。

2.4 血细胞

由表3可见，在6个指标中肾病棕黑锦蛇在红细胞和血栓细胞数量上，明显低于健康蛇，且2个指标与健康蛇之间均呈极显著性差异。而在白细胞总数，淋巴细胞、嗜中性粒细胞和中间细胞数上两者数值均近似。

表3 血细胞分类计数

Tab.3 Blood corpuscle classification of counting

注：小写字母表示显著差异(P<0.05)；大写字母表示极显著差异(P<0.01)

Note：Lowercase indicate significant correlations between data(P<0.05)；majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

2.5 血清生化指标

由于肾病蛇只有1条蛇，不满足统计分析的要求。故本实验设置相应生化指标中肾病蛇/健康蛇的比值大于150%或小于50%为问题指标(以*标记问题指标)。共检测的19个血清指标(表4)，其中9项为问题指标。血清无机盐离子含量的7个指标中(第1组)，虽肾病蛇均低于健康蛇，但仅钙磷乘积为问题指标。与肝脏功能相关的6个指标(第2组)中总胆红素、直接胆红素和间接胆红素均表现为肾病蛇低于健康蛇，其中直接胆红素为问题指标，而总胆汁酸、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶均为肾病蛇高

表4 棕黑锦蛇部分生化指标

Tab.4 The index of part biochemistry in Elaphe schrenckii

于健康蛇，且3项均为问题指标。与肾功能相关(第3组)的肌酐、尿素氮和尿酸等3项指标中肾病蛇均低于健康蛇，其中尿酸为问题指标，而肌酐含量接近问题指标的临界值。其他3项(第4组)乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶和碱性磷酸酶均为问题指标。

3 讨论

由于爬行类出现了羊膜卵，使其真正实现了陆栖生活，并以不同的方式适应着各类生境。而作为调节体内水分代谢的重要器官肾脏在其生存和繁殖中具有重要作用和意义[8-15]。蛇类肾脏疾病也有不少报道[16-18]，但未见有关肾萎缩的研究报道。在医学研究中，利用生化指标的检测以及CT成像技术可以对肾萎缩进行良好的诊断[19]。而对一般动物肾萎缩仅见对猫肾萎缩的诊疗，且诊疗手段仅为触诊，检验指标显示血液尿素氮和血清肌酐水平升高，红细胞数和红细胞压积正常或减少，血磷不同程度升高，总蛋白和血钾呈不同程度减少[20-22]。

本研究中的肾病棕黑锦蛇表现出了明显的代偿性，即右肾严重萎缩，而左肾明显肥大。虽然左肾大部分区域肾脏的基本结构和功能单位—肾单位结构正常，但已经出现了明显的结构损伤的迹象，包括肾小球的萎缩、肾小管管径的降低、细胞内的水样变性和肾小体中大量的嗜碱性物质的沉积，均反映了肾单位结构和功能有所损伤的趋势。是否提示了在爬行动物一侧肾脏的代偿能力有限，需要双侧肾脏功能的健全，而解决这个问题还需要更多的积累资料。

对血细胞分类计数的结果与陈东溟等研究结果相同[23]，均表现为红细胞数量明显减少，但棕黑锦蛇的血栓细胞(相当于血小板)也明显降低。另外，一般哺乳动物罹患肾萎缩的病例均显示肾功能指标中的肌酐、尿素氮和尿酸呈增高的现象，而棕黑锦蛇却表现出降低的趋势，这个现象是否与两种动物代谢终产物不同所致的差异，有待于进一步研究。

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Morphological Abnormality of Kidney in Artificial Breeding Amur Rat Snake(Elapheschrenckii)

Cheng Jianxin Yao Chenhao Wang Shanshan Li Pipeng*Lu Yuyan*

(Institute of Herpetology and Key Lab.Of Biodiversity and Evolution of Liaoning Province，Shenyang Normal University，Shenyang，110034，China)

During the physiometry of captive bred Amur rat snake(Elapheschrenckii)，we found a case of morphological abnormality in the kidney.Further examination was conducted by gross anatomical and histological methods and analyzed with hematological and blood biochemistry data.The kidneys of this snake were obviously different in shape and size.Compared to the normal kidney，the left kidney was much enlarged and the renal coefficient was nearly 2 times that of the normal kidney，the right one was atrophic and the renal coefficient was only 1/6 of the normal kidney.By histological examination，the general structure of the left renal parenchyma was normal and that of the right renal parenchyma was dense and nephron filled with fibroid connective tissue． The renal corpuscles were atrophic and deposited with alkaline substance in the right and left kidneys． Comparing to the normal snakes，the number of red blood cells and thrombocytes were lower and 9 of 19 blood biochemical indices differed significantly from those of normal snakes． The results indicated that the left kidney hypertrophy was compensation of the right kidney atrophy and its histological changes were a limited functional response． This kidney abnormality caused the hematological changes and the snake was in disease status． Although the cause of such appearance was not determined，more attention should be paid to husbandry practices，diet and nutrition．

Elapheschrenckii；Kidney；Morphological abnormality；Disease；Husbandry

稿件运行过程

2017-01-08

修回日期：2017-03-15

发表日期：2017-08-10

Q955

A

2310-1490(2017)03-473-07

国家林业局珍稀濒危物种野外救护与人工繁育项目(No.2130211)

程建鑫，男，25岁，硕士研究生；主要从事细胞生物学研究。E-mail：15940239445@163.com

*通讯作者：李丕鹏：E-mail：lipipeng@yahoo.com；陆宇燕：E-mail：luyuyan1962@163.com