葡萄糖碳源对组成型表达重组人C—反应蛋白的影响

李军明++++++杨丽萍++++++王臣玉++++++赵琪++++++郑清++++++孙成铭

[摘要] 目的 探讨不同浓度的葡萄糖对Pichia pastoris组成型表达重组人C-反应蛋白（rhCRP）的影响并筛选出最优葡萄糖碳源。 方法 分别以浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的葡萄糖作为碳源，利用毕赤酵母菌株组成型表达rhCRP。取不同表达时间的培养基上清进行Western blot检测及灰度比较分析。 结果 毕赤酵母菌株X-33（pGAPZαA/rhCRP）以葡萄糖作碳源组成型表达rhCRP时，1.0%（w/v）的葡萄糖为最优碳源。 结论 葡萄糖碳源的浓度可影响Pichia pastoris组成型表达rhCRP的水平。本研究结果将为rhCRP的进一步优化表达及大规模生产提供有力的实验依据。

[关键词] C-反应蛋白；葡萄糖；碳源；组成型表达；Pichia pastoris

[中图分类号] Q819 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0018-04

Influence of glucose carbon source on the constitutive expression of recombinant human C-reactive protein

LI Junming YANG Liping WANG Chenyu ZHAO Qi ZHENG Qing SUN Chengming▲

Department of Clinical Laboratory， Yantai Yuhuangding Hospital， Shandong Province， Yantai 264000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different concentrations of glucose on the constitutive expression of recombinant human C-reactive protein （rhCRP） in Pichia pastoris， and to screen out the optimum concentration of the glucose carbon source. Methods The different concentrations [0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， 2.5%， 3.0% and 3.5% （w/v）] of glucose were used to constitutively express rhCRP in Pichia pastoris. Samples were taken from individual tubes of the cultures at the desired time points and the expression of rhCRP in the culture supernatant was analyzed by Western blot and gray scale. Results When rhCRP was constitutively expressed in Pichia pastoris X-33 using glucose as carbon source， 1.0% glucose （w/v） was selected as the best carbon source. Conclusion The concentration of glucose carbon source plays an important role in the constitutive expression of rhCRP in Pichia pastoris. The results of this study will provide a strong experimental basis for further optimized expression and large-scale production of rhCRP.

[Key words] C-reactive protein； Glucose； Carbon source； Constitutive expression； Pichia pastoris

C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是一种系统发育上十分古老、结构上高度保守的典型的急性时相反应蛋白[1]。人们对它的研究已有80余年的历史，发现其生物作用似乎相当复杂，它不仅是灵敏的炎症指标[2-4]，而且是心血管疾病最强有力的风险预测因子[5-8]。从患者血清或腹水中直接分离纯化得到人CRP是困难的[9]，目前主要通过外源表达系统获来得重组人CRP（recombinant human C-reactive protein，rhCRP）[10-13]。然而，提高rhCRP的表达水平仍然是一个具有挑战性的任务。碳源是影响Pichia pastoris组成型表达外源蛋白的重要因素之一[14]。本文着重研究了不同浓度的葡萄糖对工程菌株组成型表达rhCRP的影响，旨在筛选出最优浓度葡萄糖碳源，以优化CRP的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株与主要试剂 毕赤酵母X-33、Zeocin抗生素、质粒提取及DNA凝胶回收试剂盒购自Invitrogen公司，限制性核酸内切酶、E.coli JM109购自TaKaRa公司，表达载体pGAPZαA/rhCRP为前期构建冻存样本。葡萄糖、PVDF膜、抗His-Tag-HRP单克隆抗体及膜型TMB显色液为Sigma公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯。endprint

1.1.2 主要培养基 LB、LS-LB、YPD、YPDS培养基，均参照Invitrogen公司提供的配方；BMY培养基[1%胰蛋白胨、2%酵母提取物、100 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、1.34%酵母氮碱、4×10-5%生物素]。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pGAPZαA/rhCRP的准备与提取 前期已根据GenBank（X56214.1）数据库中公布的编码人CRP的基因序列及组成型载体pGAPZαA上酶切位点的特性设计并成功克隆出重组质粒pGAPZαA/rhCRP[15]。通过热击法将经测序鉴定的重组质粒pGAPZαA/rhCRP转化至大肠埃希菌感受态细胞JM109，然后涂布于含Zeocin 25 μg/mL的LS-LB固體平板上，37℃过夜培养。取阳性单克隆菌落进行接种，37℃、220 r/min过夜培养后提取重组质粒pGAPZαA/rhCRP，用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切进行鉴定。

1.2.2 重组质粒的酵母转化与表达鉴定 将经Bsp HI线性化的重组质粒pGAPZαA/rhCRP用电击法转化到酵母菌X-33中，并涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板上，于30℃培养2～3 d后取单克隆菌落于纯化平板上进行再次筛选。挑选大而圆的单克隆，接种到5 mL YPD液体培养基中30℃振荡培养30 h后取样。将样品10 000 r/min离心5 min后取适量上清进行SDS-PAGE电泳，然后转膜至PVDF膜上，以HRP标记的抗组氨酸抗体为抗体，并用膜型TMB显色液进行显色后分析Western blot结果。

1.2.3 利用不同浓度葡萄糖碳源进行rhCRP的优化表达 将阳性单克隆菌株接种至装有80 mL YPD培养基的2 L摇瓶中，30℃振荡过夜培养后，将其分别分装到7个容积为50 mL的离心管中，每管10 mL。于1500 r/min常温离心5 min，轻弃上清后向7个管中依次加入葡萄糖浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的BMY新鲜液体培养基各10 mL。轻摇重悬菌体后至于30℃摇床中220 r/min振荡培养6 d。在16、24、48、72、96、120、144 h时从上述7管中依次取样，并每24小时向7个浓度梯度的培养管中分别补充葡萄糖碳源至设定浓度。将样品于10 000 r/min离心5 min后保留上清以进行Western blot分析，并用Quantity One软件进行灰度比较及综合分析。

2 结果

2.1 重组质粒pGAPZαA/rhCRP的酶切鉴定

用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切提取的4管重组质粒pGAPZαA/rhCRP，电泳后可见约为681 bp的目的条带和3491 bp的pGAPZαA载体条带（图1），片段大小位置与预期相符。酶切鉴定与预期结果一致。

2.2 酵母转化后的初步表达鉴定

Western blot鉴定结果显示，挑选的阳性单克隆菌株表达出了大小约23 kD的目的条带（图2），符合预期结果。

2.3 不同浓度葡萄糖碳源对Pichia pastoris组成型表达rhCRP的影响

如图3a、3b所示，24 h和48 h的样本Western blot检测结果显示，最佳葡萄糖碳源浓度为1.0%（w/v）；如图3c、3d所示，96 h和120 h的检测结果显示，最佳葡萄糖碳源浓度为0.5%（w/v）。

对0.5%和1.0%（w/v）浓度的葡萄糖作碳源时rhCRP在7个不同时间的表达情况进行了进一步分析，结果表明，最佳葡萄糖碳源浓度为1.0%（w/v）。

1～7：浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（w/v）的葡萄糖作碳源时，Pichia pastoris X-33/pGAPZαA/rhCRP表达24 h（a）、48 h（b）、96 h（c）和120 h（d）时的培养基上清液经Western blot检测结果

M：蛋白Marker；D、G：分别表示浓度为0.5%、1.0%（w/v）的葡萄糖作碳源时，Pichia pastoris X-33/pGAPZαA/rhCRP表达16、24、48、72、96、120、144 h时的培养基上清液经Western blot检测鉴定（a）及灰度比较分析（b）结果

3 讨论

目前，人们已利用多种外源表达系统成功表达了rhCRP[10-13]，但将其应用到产业化生产时，都存在一定的弊端。提高rhCRP产量仍然是一个亟需解决的难题。Pichia pastoris的组成型表达系统是具有强启动子的非常优秀的真核表达系统，已成功用于多种重组蛋白的生产[16]。该系统可以利用信号肽分泌表达目的蛋白，可大大简化后期的蛋白纯化工艺[17-18]。更重要的是，该组成型表达系统不仅可以避免使用有毒、易燃、储存及运输成本高的甲醇，而且可以利用葡萄糖等多种经济安全物质作为碳源，将更利于其在大规模工业化生产中的应用。

大量研究发现，碳源的种类与浓度是影响毕赤酵母组成型表达外源蛋白产量的重要因素之一[19-20]。除了实验没有更好的办法可以确定利于目的蛋白表达的最优碳源[21]。本研究选取了经济的葡萄糖作为碳源，研究不同浓度的葡萄糖碳源对rhCRP表达的影响。结果发现，24 h和48 h时1.0%（w/v）的葡萄糖为最佳浓度，然而有意思的是96 h和120 h的检测结果显示最佳葡萄糖碳源浓度为0.5%（w/v）。于是，本研究对葡萄糖碳源浓度分别为0.5%和1.0%（w/v）时，rhCRP在不同时间（16、24、48、72、96、120、144 h）的表达情况进行了进一步分析，结果显示，以0.5%（w/v）葡萄糖作为碳源时，72 h时rhCRP的表达量接近最大值，之后随着时间的延长表达量变化不明显；而以1.0%（w/v）葡萄糖作为碳源时，48 h时rhCRP的表达量已接近最大值，之后随着时间的延长表达量变化不明显。显然，短的培养时间不仅可以提高生产效率，而且可以减少了杂蛋白的产生，利于后期蛋白纯化操作。所以，葡萄糖碳源的最佳浓度为1.0%（w/v）。本研究结果将为rhCRP的进一步优化表达及大规模生产提供有力的实验依据。endprint

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（收稿日期：2017-07-16 本文编辑：程 铭）endprint