异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质型肝癌病证模型大鼠Id4和p21 mRNA表达水平的影响

祖力皮喀尔·阿卜杜热合曼　王延蛟+++娜孜拉木·玉苏甫江　古丽尼格尔·雪合拉提　斯坎德尔·白克力

[摘要] 目的 探討维药异常黑胆质成熟剂在异常黑胆质型肝癌病证大鼠模型中的抗肝癌作用。 方法 90只清洁级雄性Wistar大鼠按随机数字表法分成正常组、对照肝癌组、异黑肝癌组和成熟剂高、中、低剂量组6组，每组各15只。正常组正常饲养，对照肝癌组正常饲养21 d后给予二乙基亚硝胺（DEN）20周诱导肝癌。异黑肝癌组和成熟剂高、中、低剂量组大鼠通过干寒属性饲料、干寒气候环境、足底电刺激，夹尾以及强迫游泳等多因素复合作用21 d建立异常黑胆质证载体动物模型，再加用DEN20周诱导建立异常黑胆质型肝癌病证模型；DEN诱导的同时，成熟剂高、中、低剂量组用异常黑胆质成熟剂按高、中、低（6.0、3.0、1.5 g/kg）剂量进行干预。提取肝组织中mRNA，利用基因芯片技术筛选出的大鼠肝脏差异表达的Id4和p21候选基因并用RT-qPCR法验证。 结果 与正常组比较，对照肝癌组肝组织Id4基因表达下调（P < 0.01）；与对照肝癌组比较，异黑肝癌组肝组织Id4基因表达下调（P < 0.01）；与异黑肝癌组相比，成熟剂高、中、低剂量肝组织Id4基因表达均上调，其中成熟剂高、中剂量组升高显著（P < 0.01）。与正常组相比，对照肝癌组肝组织p21基因表达上调（P < 0.01）；与对照肝癌组比较，异黑肝癌组肝组织p21基因表达上调（P < 0.05）；与异黑肝癌组相比，成熟剂高、中、低剂量肝组织p21基因表达均下调，其中成熟剂中、低剂量组下降明显（P < 0.01）。 结论 异常黑胆质成熟剂可影响异常黑胆质型肝癌病证模型大鼠肝脏Id4和p21基因的mRNA表达水平。

[关键词] 异常黑胆质型肝癌；异常黑胆质成熟剂；Id4；p21

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0009-05

The influence of Abnormal Savda Munziq on mRNA expressions of Id4 and p21 genes in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models

Zulipikaer·Abudureheman WANG Yanjiao Nazilamu·Yusufujiang Gulinigeer·Xuehelati Sikandeer·Baikeli

Department of Molecular Biology， Basic Medical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To investigate the anticancer role of Uyghur medicine Abnormal Savda Munziq （ASM） in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models. Methods 90 male Wistar rats were divided into 6 groups， including normal group， control hepatic carcinoma group， abnormal savda hepatocellular carcinoma group and ASM high， middle and low dosage group by random number table， with 15 cases in each group. The normal group rats were placed in normative feeding environment. After 21 days of feeding in laboratory environment， the control hepatic carcinoma group rats were induced by diethylnitrosamine （DEN） 20 weeks to establish the liver cancer rat model. The rats in the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， ASM high， middle and low dosage group were established abnormal black bile models， through dry cold property feed， dry cold climate environment， plantar electrical stimulation， tail and forced swimming， etc； after 21 days they were induced by DEN for 20 weeks to establish the abnormal savda hepatocellular carcinoma models. At the same time， the rats in the ASM high， middle and low dosage group were intervened by 6.0， 3.0， 1.5 g/kg of ASM. The mRNA was extracted from liver tissue and Id4， p21 gene were verified by RT-qPCR after screened by gene chip technology. Results The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in control hepatic carcinoma group ，compared with the normal control group （P < 0.01）. The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expression of Id4 gene in liver tissue was up-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the high and middle dosage groups were obviously up-regulated （P < 0.01）. Compared with the normal group， the liver tissue p21 gene expression was up-regulated in control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. The p21 gene expression in liver tissue wasup-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.05）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expressions of p21 gene were down-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the middle and low dosages group were dramatic decline （P < 0.01）. Conclusion The ASM could have an impact on mRNA expressions of Id4 and p21 gene in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models.endprint

[Key words] Abnormal savda hepatocellular carcinoma； Abnormal Savda Munziq； Id4； p21

肝癌是危害人类健康的恶性肿瘤，在各类恶性肿瘤的发病率与死亡率中分别排在第四与第二位，我国肝癌的发病率和死亡率在全球处于高水平[1]。维吾尔医学是中华传统医学的重要组成部分，具有丰富的临床实践和传统的理论体系，是传统维医药学理论的核心。在维吾尔医学临床治疗方剂中，异常黑胆质成熟剂经常用于治疗和预防异常黑胆质型肿瘤、哮喘等疑难性复杂疾病，但其分子机制尚未清楚[2]。本研究在前期建立的异常黑胆质型肝癌病证动物模型[3-4]的基础上，通过基因芯片技术筛选出差异表达的DNA结合抑制因子4（inhibitor of DNA binding 4，Id4）和细胞周期依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，p21）等候选基因，通过RT-qPCR法进行验证，对维药异常黑胆质成熟剂的抗肝癌作用进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

选取清洁级雄性90只Wistar大鼠（提供单位：新疆医科大学动物实验中心），体质量为130～160 g，动物合格证号：65000700000538。

1.2 主要试剂与仪器

小鼠跳台仪（型号：JXDT-1，上海精宏实验设备有限公司）、人工气候箱（RQH-350型，上海精宏实验设备有限公司）、电子天平（BS-110型，北京赛多科斯天平有限公司）、光学显微镜（Leica Microsystems，DMI 6000B）、RT-PCR仪（BIO-RAD，MyCyclerTM Thermal Cycler，580BR）、RT-qPCR仪（BIO-RAD，iCyclerTM Thermal Cycler，582BR）、异常黑胆质成熟剂（批号：121011，提供单位：疆维吾尔自治区维吾尔医医院）、cDNA合成试剂盒（产品号：#K1622，Thermo Scientific，）、RT-qPCR荧光定量试剂盒（产品号：#RR820A，TAKARA Bio）、二乙基亚硝胺（DEN）（Sigma公司产品）。

1.3 实验方法

1.3.1 药物 异常黑胆质成熟剂由甘草、黑种草子、蜀葵子、芹菜根、菊苣根、骆驼蓬子、茴芹果、罗勒子、茴香根皮、菊苣子、香青兰子、香茅和洋甘菊等十几种天然草药组成，根据国家发明专利《能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物及其制备方法》[5]（专利号：ZL02130082.8），用旋转蒸发仪浓缩成膏稠状之后，60℃真空干燥备用，每克药粉含3.4 g生药，使用时用双蒸水充分溶解使用。

1.3.2 动物分组 选取清洁级雄性Wistar大鼠90只室温（25±3）℃环境下稳定饲养3 d，随机分成实验组（60只）和对照组（30只）。实验组大鼠按随机数字表法分为异常黑胆质型肝癌病证模型组（异黑肝癌组）和异常黑胆质型肝癌病证3个不同剂量异常黑胆质成熟剂给药组（成熟剂高、中和低剂量组），每组各15只。根据相关文献[3-4]，实验组通过基础饲料、芫荽子和大麦以7∶1.5∶1.5的比例混合，制成干寒属性饲料，把动物置于干寒气候环境[温度（6±1）℃，相对湿度30%，6 h/d]，间断电刺激大鼠足底（第1周刺激电压是25 V，每次20 min，1次/d；第2周的刺激电压是30 V，每次25 min，1次/d；第3周刺激电压是35 V，每次30 min，1次/d），短暂夹住大鼠尾部尖端1cm处（3～5次/个，1次/d），强迫游泳[每次5 min，1次/d，水温（25±3）℃]等多种复合因素作用下21 d建立异常黑胆质证载体大鼠模型。随后每天用灭菌水配制浓度为0.1 mg/mL的DEN溶液，自由飲用直到20周。给予DEN诱导的同时，成熟剂高、中、低剂量组每天对大鼠灌胃成熟剂高、中和低剂量的异常黑胆质成熟剂，相当于临床应用的等效剂量（6.0、3.0和1.5 g/kg）。并且给实验组大鼠持续进行异常黑胆质证造模多种复合因素，直到实验结束。对照组按随机数字表法分成对照肝癌组和正常对照组（正常组）。正常组大鼠在正常饲养环境下[室温（25±3）℃]，用普通饲料饲养，饮食和饮水不受限制，也不受任何刺激。21 d时，对照肝癌组仅把饮用水改为用灭菌水配制的0.1 mg/mL的DEN溶液，自由饮用。20周时处死动物，肝组织-80℃冰箱保存备用。

1.3.3 样品处理 第20周时处死大鼠切出肝脏组织，切成若小块，用10%的甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察。

1.3.4 基因芯片分析 基因芯片委托北京博奥生物技术有限公司完成。

1.3.5 RT-PCR 大鼠肝脏利用Trizol法进行总RNA抽提，逆转录合成cDNA ；委托上海生工生物工程技术服务有限公司北京分公司合成Id4和p21基因引物。GAPDH，F：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，R：5′-TGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；Id4，F：5′-AA？鄄AGCCACCAGAGGAAAGGAA-3′，R：5′-CATGTAACA？鄄CAACGTCGCCAA-3′；p21，F：5′-CGAGAACGGTGGAACTTTGA-3′，R：5′-GAAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3′。

采用SYBR Green I*嵌合荧光试剂盒进行 RT- PCR实验。反应条件：预变性：95℃ 30 s，1个循环；扩增：95℃ 5 s，TM（Id4：57℃；p21：59.2℃）30 s，72℃ 1 min，40个循环；溶解曲线：55～95℃ 1个循环/0.5℃。RT-qPCR结果以2-ΔΔct法进行计算。endprint

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察结果

除了正常组，实验后期其余各组动物均因为肝癌出现不同数量的死亡情况，对照肝癌组死亡率为40%（6/15），异黑肝癌组为40.0%（6/15），成熟剂高剂量组为13.3%（2/15），中剂量组为0%（15/15），低剂量组为26.7%（4/15）。

肝脏大体观察结果发现，正常组动物肝组织柔软，红润，表面光滑。对照肝癌组瘤结节大小及分散不均，灰白色质较软，突出明显，与周围组织界限清楚。异黑肝癌组肝脏高度水肿，瘤结节呈球状严重，大小不均，分散于肝脏各处，瘤结节向表面隆起明显，黄疸较多，肝脏肿大及表面凹凸不平。成熟剂高剂量组和中剂量组动物肝脏表面较为平整，水肿程度有所缓解，少有结节；与上述两个剂量组相比，成熟剂低剂量组动物肝脏瘤结节相对较多及大小不均，肝脏水肿程度较明显，肝组织表面凹凸较明显。见图1，封三。

2.2 肝脏病理观察结果

正常组大鼠肝组织细胞结构完善，清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列规则，呈索状，肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常，无异常变化。对照肝癌组肝细胞成团块状或排列成条索状，细胞不典型增生明显，并向周围正常肝细胞浸润生长。异黑肝癌组肝细胞异型性明显，胞核增大，胞质少，可见较多畸形的单核和多核瘤巨细胞。成熟剂高、中、低剂量组肝脏部分肝细胞异常改变，核大，颜色深，癌变程度有所缓解，其中高剂量组与正常组较为接近。见图2，封三。

2.3 基因芯片结果

通过MAS系统软件分析选出差异表达2倍以上的候选基因，用TreeView软件制作聚类分析图。红色为表达上调的基因，绿色为表达下调的基因。横列：不同肝组织标本；纵排：差异表达基因（图3，封四）。根据SAM软件分析所得数据，选择了成熟剂高、中、低剂量组与异黑肝癌组均有差异表达的候选基因Id4和p21。

2.4 RT-qPCR结果

与正常组比较，对照肝癌组肝组织Id4基因表达下调（P < 0.01）；与对照肝癌组比较，异黑肝癌组肝组织Id4基因表达下调（P < 0.01）；与异黑肝癌组比较，成熟剂高、中、低劑量组肝组织Id4基因表达均上调，其中成熟剂高、中剂量组差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与正常组相比，对照肝癌组肝组织p21基因表达水平上调（P < 0.01），异黑肝癌组与对照肝癌组相比p21基因表达水平上调（P < 0.05），成熟剂高、中、低剂量组与异黑肝癌组相比均下调表达，其中成熟剂中、低剂量组差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

本研究通过检测异常黑胆质型肝癌病证大鼠肝组织中差异表达候选基因Id4、p21的mRNA表达水平，探讨异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质型肝癌大鼠模型中Id4、p21基因表达的影响。结果发现，与正常组相比，对照肝癌组Id4基因mRNA表达水平下调，p21基因mRNA表达水平上调（P < 0.01）。Id4是螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）转录因子家族成员[6]，通过与bHLH蛋白形成异二聚体，导致bHLH蛋白结构发生变化并抑制其与DNA结合，从而抑制转录调控，是转录因子bHLH的负调控因子[7]。此外，Id4调控p53、p21等转录因子和细胞周期相关基因[8-9]和转化生长因子（TGF-β1）等细胞生长因子[10]，参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡，促进细胞增殖、肿瘤形成以及肿瘤血管形成等过程[11]。因此，Id4基因既可作为抑癌基因，也可作为癌基因，与肿瘤的发生和发展关系密切而复杂。有报道称，由于启动子甲基化导致表达沉默、缺失及失活，在淋巴瘤[12]、骨髓增生综合征[13]、乳腺癌[14]、前列腺癌[15]等若干种人类肿瘤中起抑癌基因的作用。也有报道称Id4基因在肺癌[16]、肝细胞癌[17]等肿瘤组织中因促进细胞增殖起促癌基因作用。本实验结果显示，对照肝癌组Id4基因的mRNA表达水平下调，因此认为Id4基因可能在此动物模型肝组织中起抑癌基因的作用，这与文献[17]描述的Id4基因功能不一致，但与部分文献结果一致[14-15]，可能是因为Id4基因在不同物种或不同肿瘤组织中的表达有所不同，Id4基因在肝癌中的作用需进一步研究。

在细胞周期G1期过渡到S期过程中，p21能与细胞周期依赖性激酶结合并抑制其活性，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，与细胞周期关系密切[18]。研究者发现DNA损伤信号是p53、p21基因转录激活的重要原因之一[19]。通过DNA损伤应激活化的细胞周期检查点机制，延迟或阻断细胞周期进程，损伤无法修复时则诱导细胞凋亡[20]。临床研究显示，p21基因mRNA表达水平肿瘤患者高于非肿瘤患者，提出p21基因的高表达可能与肝细胞肝癌有一定关系，可为筛检肝细胞肝癌高危人群提供参考依据[21]。因此认为本研究中p21基因在肝组织中的表达上调与肝癌的发生和发展有着密切的关系。本研究组前期的免疫组织化学结果也显示，对照肝癌组及异黑肝癌组p21基因表达水平显著高于正常组，与异黑肝癌组相比成熟剂不同剂量给药组p21基因的表达均下调，且提出异常黑胆质成熟剂可能通过影响p21基因的表达起抗肝癌作用的结论[22]，与本次试验结果一致。

维吾尔医学体液论是维吾尔医学认识人体结构、生理功能、病理现象以及进行诊断和治疗的理论基础。维吾尔医学体液论认为异常黑胆质证是慢性病理生理状态，是肿瘤等疑难复杂性疾病的共同特点[23]。根据维医临床治疗经验，异常黑胆质型肿瘤、哮喘等复杂性疾病常用异常黑胆质成熟剂进行治疗。在前期异常黑胆质型肝癌病证动物模型的研究中发现，异常黑胆质证能促进肝硬化的发生和发展，并且在造模20周时，异常黑胆质型肝癌病证动物模型组和对照肝癌组大鼠肝脏均发生癌变，且成癌率前者明显高于后者[4]；研究还发现在该动物模型中异常黑胆质成熟剂防止肝硬化和肝癌的发生发展[24]，但其作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基础上[3-4，24]建立了异常黑胆质型肝癌模型并用基因芯片技术筛选出肝组织差异表达的候选基因，用RT-qPCR法进行验证结果显示，异常黑胆质型肝癌病证大鼠模型肝组织Id4和p21基因表达水平与对照肝癌组相比存在差异，说明异常黑胆质证能促进肝癌的发生和发展，而异常黑胆质成熟剂可能通过调控Id4和p21基因的mRNA表达水平起抗肝癌作用。endprint

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（收稿日期：2017-07-17 本文编辑：李岳泽）endprint