人工繁育藏酋猴血液学及血液生化部分指标正常参考值测定

杨 锋 陈 辉 谢晓娟 曾 雅 余晓君

(四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，成都，610212)稿件运行过程

人工繁育藏酋猴血液学及血液生化部分指标正常参考值测定

杨 锋 陈 辉 谢晓娟 曾 雅 余晓君

(四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，成都，610212)稿件运行过程

藏酋猴；血液学；血液化学；正常参考值

目的：了解在人工繁育条件下，不同性别和年龄藏酋猴血液学和血液化学部分指标的正常参考值范围，为藏酋猴标准化养殖及实验室运用提供参考数据。方法：利用全自动血液细胞分析仪和全自动血液生化分析仪，测定119只健康藏酋猴血液学和血液生化值，并对不同性别、不同年龄段藏酋猴检测结果进行分析比较。结果：按年龄分组，成年组的LYM、RBC、HGB、HCT、BUN、Alb、TC等指标，老年组WBC、BASO、RDW、MCHC、Na、CL等指标与青年组比较有明显差异(P<0.05)；老年组HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、Crea、Na等指标与成年组比较有明显差异(P<0.05)；按性别分组，成年组和老年组与青年组比较，有明显差异的指标更多。结论：本研究对人工饲育的健康藏酋猴建立了常用指标的参考范围，为其在生物医学领域的运用提供了参考的依据，同时，对藏酋猴背景数据库的建立提供了有效的支撑。

实验动物被公认为“活的试剂”、“活的精密仪器”，在生物医药产业的运用日趋广泛，其发展和应用的程度对衡量一个国家和地区科学技术水平的能力起着越来越重要的作用，很多具有独特价值的实验动物被作为“战略资源”被严格控制，非人灵长类动物因其在许多生物学特性方面都与人类较为接近，运用价值远远超过其他品种的实验动物，受到更严格的管控。目前国内外常用的非人灵长类实验动物为猕猴(Macacamulatta)和食蟹猴(Macacafascicularis)。其体型适中，标准化程度高，多用于药物毒理学研究，而藏酋猴(Macacathibetana)因其体型较大、耐受力强、代谢稳定等特点，正逐渐引起国内外专家的关注。2013年第四军医大学西京医院利用藏酋猴完成了国际首例“转基因猪-藏酋猴异种异位脾窝辅助性肝部分移植术”实验，受体动物(藏酋猴)打破了异种移植中移植物和受体存活时间的世界纪录，为科研人员在非人灵长类动物的使用有了新的选择方向。

四川省医学科学院、四川省人民医院实验动物研究所自2005年开始从事藏酋猴人工培育和实验动物标准化研究工作，经过10余年的人工繁育，目前藏酋猴数量接近500只，基本形成老、青、幼三代繁育体系，为藏酋猴运用于科研试验、新药开发及安全性评价打下了坚实基础。本研究利用全自动血液生化分析仪及全自动血液细胞分析仪，针对新药临床前研究技术指导原则涉及的相关指标，对藏酋猴血液学及血液生化学部分参数进行检测，并根据不同年龄、性别进行分析，初步建立正常参考区间，为藏酋猴的基本生理数据指标的累积和分析提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本次实验藏酋猴由四川省医学科学院、四川省人民医院实验动物研究所养殖研究室提供。根据牙齿更新情况进行年龄判断[1]，分为青年组、成年组、老年组(表1)。所选动物外观正常，非生理周期，无怀孕个体，活动自如，每日饲育2次，辅以水果及青饲料，自由饮水，根据《实验动物 寄生虫学等级及监测GB 14922.1》、《实验动物 微生物学等级及检测GB 14922.2》相关内容进行筛查，挑选满足要求的个体进行样本采集，完成检测。

表1 藏酋猴年龄、体重分组情况

Tab.1 Tibetan macaque group based on different age and weight

注：*青年组与成年组和老年组比较，P<0.05；#青年组雄性与成年组和老年组雄性比较，P<0.05，与老年组雌性比较，P<0.05；△青年组雌性与成年组和老年组雄性比较，P<0.05

Note：Comparation between the youth and the old groups，as for *，P<0.05；in the male，for #，P<0.05；in the old，P<0.05；comparetion with the female in the youth group and the male in the adult and old group，as for △，P<0.05

1.2 主要仪器、试剂

1.2.1 仪器

全自动血液细胞分析仪(Sysmex-XN 20)，全自动生化仪(日立LABOSPECT-008)。

1.2.2 试剂

均为仪器配套试剂。

1.3 检测方法及指标[2]

1.3.1 血常规检测

利用阻抗法、化学染色法及光散射法对血液样本的相关参数进行分析，指标包括白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、网织红细胞百分比(RET%)。

1.3.2 血液生化检测

尿素氮BUN(紫外-谷氨酸脱氢酶法)、肌酐Crea(肌氨酸氧化酶法)、总胆红素Tbil(钒酸盐氧化法)、总蛋白TP(双缩脲法)、白蛋白Alb(溴甲酚绿法)、葡萄糖GLU(葡萄糖氧化酶法)、总胆固醇TC(氧化酶法)、甘油三酯TG(氧化酶法)、钾离子K(离子选择电极法)、氯离子Cl(离子选择电极法)、钠离子Na(离子选择电极法)。

1.4 血液样本采集

藏酋猴禁食14～16 h，工作人员利用吹管将采集个体麻醉，移入采集室，固定在保定架上5 min，采集后肢静脉血，其中，EDTA抗凝管(紫色)采集2 mL用于血常规检测，非抗凝管(红色)采集3 mL用于血液生化检测。

1.5 样本处理

1.5.1 血液生化样本

非抗凝管采集后在室温放置10 min，对称放入高速离心机3 000 r/min，离心5 min，小心分离清亮血清，避光备用。

1.5.2 血液常规样本

抗凝管准确接取2 mL血样后，轻微颠倒摇匀2～3次，放入试管架备用。

1.5.3 所有样本在离体后4 h内完成检测。

1.6 分析方法

利用SPSS18.0统计软件，计算平均值和标准差(Mean±SD)，描述参考值范围(极小值～极大值)，组间比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 年龄及体重

藏酋猴成年组和老年组体重高于青年组(P<0.05)，从整体分布趋势观察，不同年龄段雌性藏酋猴体重增长稳定，基本符合正常的发育趋势(表1)。

2.2 血液常规检测

成年组和老年组的WBC、LYM、BASO、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、BUN、Alb、TC、Na、Cl等指标与青年组比较有明显差异(P<0.05)，老年组HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、Crea、Na、Cl等指标与成年组比较有明显差异(P<0.05)(表2，表4)。

2.3 血液生化检测

青年组雌性WBC、NEU、LYM、MONO、RET%、BUN、Crea、Alb、TG、CL，成年组雄性BUN，成年组雌性NEU、BASO、RBC、HGB、HCT、MCHC、RET%、BUN、Crea、TP、Alb、TBIL、TC、TG，老年组雄性Alb、K，老年组雌性RET%、TG、Na等指标与青年组雄性比较，有明显差异(P<0.05)；成年组雄性WBC、LYM、MONO、PLT、RET%、Crea、TG、CL，成年组雌性LYM、MONO、HGB、HCT、TP、Alb、GLU，老年组雄性WBC、LYM、BASO、MCV、RDW、RET%、K，老年组雌性WBC、NEU、MONO、BASO、Na、Cl等指标与青年组雌性比较，有明显差异(P<0.05)(表3，表5)。

表2 藏酋猴不同年龄段血液常规检测结果及范围

Tab.2 Hematological detection at different age

续表2

注：*与青年组比较，P<0.05；△与成年组比较，P<0.05

Note：* Comparation with the youth groups，P<0.05；as for △，P<0.05

表3 藏酋猴不同性别各年龄段血液常规检测结果

Tab.3 Hematological detection at different age based on sex

注：*与青年组雄性比较，P<0.05；△与青年组雌性比较，P<0.05

Note：* Comparation with the male in youth group，P<0.05；as for △，P<0.05

表4 藏酋猴不同年龄段血液生化检测结果及范围

Tab.4 Blood biochemical detection at different age

注：*与青年组比较，P<0.05；△与成年组比较，P<0.05

Note：Comparation with the male in youth group，as for *，P<0.05；as for △，P<0.05

表5 藏酋猴不同性别各年龄段血液生化检测结果

Tab.5 Blood biochemical detection at different age based on sex

注：*与青年组雄性比较，P<0.05；△与青年组雌性比较，P<0.05

Note：Comparation with the male in youth group，as for *，P<0.05；as for △ in the female youth group，P<0.05

3 讨论

目前，国内常用的非人灵长类实验动物是猕猴、食蟹猴，针对猕猴、食蟹猴血液学及血液生化学指标的研究较多[3-6]，参考范围也基本确定。藏酋猴作为四川特有的非人灵长类资源，其在实验动物中的开发具有较大的科研潜力，但国内关于藏酋猴血液学及血液生化学检测指标报道较少[7]，无可靠的检测结果作为实验的选择依据，本研究全部采用标准养殖条件下的藏酋猴血液标本，实验数据稳定可靠。

血液学指标是反映机体状况的重要参数，是衡量营养吸收、机体代谢、生理状态的重要指标，也是在科学实验中进行动物筛选、结果评价的重要因素，本研究对青年、成年、老年三代藏酋猴15项血液学指标和11项血液生化指标进行测定，了解其不同年龄、性别各指标的差异，并首次罗列了各指标的分布范围。

从本次检测结果观察中我们发现：

3.1 按年龄分组，血液学指标WBC、RBC、HGB、HCT、MCHC、RDW等多项参数，青年组与成年组或老年组比较有明显的差异，从列举的范围区间发现，老年组的藏酋猴多数指标的分布范围低于成年组和青年组，说明青年组和成年组由于年龄增长、成长环境、营养吸收等多种因素，导致的血液学指标波动较大；血液生化指标BUN、Crea、ALb、TC、Na、Cl等多项指标，老年组与成年组、青年组比较有明显差异，从列举的范围区间发现，BUN、Crea、GLU、Cl等参数，老年组与中、青年组比较呈上升趋势，Alb、TBIL、TG、K等参数，老年组呈与中、青年组比较下降趋势，从藏酋猴行为观察及数据分析，应为个体差异造成，应属正常范围内波动。

3.2 按性别分组，血液学指标WBC、NEU、LYM、MONO、BASO、RBC、HGB、HCT、MCHC、RET%，青年组雄性与青年组、成年组雌性比较有明显差异；而WBC、NEU、LYM、MONO、BASO、RBC、HGB、HCT、MCV、RDW、RET%，青年雌性与青年雄性、成年雄性和雌性、老年雄性和雌性比较有明显差异；血液生化指标BUN、Crea、TP、Alb、TBIL、TC、TG、K、Na、Cl等多项指标，青年组雄性与青年组雌性、成年组雌性和雄性、老年雌性和雄性比较有差异；Crea、TP、Alb、GLU、TG、K、Na、Cl等多项指标，青年组雌性与青年组雄性、成年组雌性和雄性、老年雌性和雄性比较有差异。

3.3 从整体数据的波动范围观察，并与已报道的其他非人灵长类动物比较，多数指标与其他非人灵长类动物相比一致性较好。但藏酋猴体型较大，利于进行器官移植等科研实验，具有较大的开发利用价值。

本次研究对藏酋猴进行合理的筛选，采集样本的个体均为繁育种群的健康动物，采血过程、样本处理、检测方法及结果处理条件一致，检测结果的可信度较高。通过对藏酋猴基础指标的检测，了解各项指标的分布范围，对藏酋猴标准化繁育、动物实验数据库的建立有着重要意义。

[1] 施新猷.医用实验动物学[M].西安：陕西科学技术出版社，1989：57.

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.北京：中华人民共和国卫生部医政司，2006：406-423.

[3] 季芳，饶军华，刘晓明.人工饲养恒河猴血液生化正常参考值的测定与分析[J].中国比较医学杂志，2006，16(6)：345-349.

[4] 王冬平，隋丽华，洪宝庆，等.蟹猴与猕猴血液生理和生化指标的比较[J].中国比较医学杂志，2007，17(7)：400-402，434.

[5] 刘仕刚，谢亮.华东地区人工饲养食蟹猴血液常规和血清生化值的测定[J].实验动物科学，2012，29(2)：34-37.

[6] 石巧娟，初明明，田朝阳，等.人工饲养食蟹猴血液常规和生化指标测定[J].实验动物与比较医学：2012，32(4)：344-347.

[7] 杨锋，王红星，周亮，等.藏酋猴外周血细胞及血清生化指标测定与分析[J].四川动物，2010，29(6)：1000-1001.

Tibetan macaque；Hematological index；Blood biochemical index；Normal inference range；Establishment

Reference on Hematological and Blood Biochemical Normal Index in Captive-Bred Tibetan Macaque

Yang Feng Chen Hui Xie Xiaojuan Zeng Ya Yu Xiaojun

(Experimental Animals of Sichuan Provincial People’s Hospital，Medical Sciences Academy of Sichuan Province，Chengdu，610212，China)

To understand the normal index reference of hematological and blood biochemistry of tibetan macaque of various age and both sexes，and to provide reference for the standard breeding and application in laboratory，we tested 15 hematological indexes and 11 blood biochemical indexes of 119 healthy Tibetan macaques，and compared the data by age and sex.Lymphocyte，red blood cell count，hemoglobin，hematocrit，blood urea nitrogen，albumin and total cholesterol of adult group and white blood cell count，basophil，red blood cell volume distribution width，mean corpuscular hemoglobin concen tration，natrium and chlorine of older macaques differed significantly from those of young macaques(P<0.05).Hemoglobin，hematocrit，mean corpuscular volume，mean corpuscular hemoglobin，mean corpuscular hemoglobin concen tration，creatinine and natrium of the old group differed significantly from those of the adult group.More indexes of the adult and old group differed from those of young group when compared by sex.This research provided a normal inference range for breeding Tibetan macaque，which could be applied in biomedicine，and supported the Tibetan macaque foundation databases.

2017-04-22

修回日期：2017-05-23

发表日期：2017-11-10

Q959.8 Q592.1

A

2310-1490(2017)04-587-06

国家重点基础研究计划：异种肝脏移植免疫耐受机制及诱导(2015CB554100)

杨锋，男，44岁，助理研究员；现从事实验动物质量控制工作。E-mail：410583808@qq.com