土壤镉污染对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）和加州腔蚓（Metaphire californica）体表角质层的影响

张慧琦，王坤，岳士忠，乔玉辉

中国农业大学资源与环境学院，北京 100193

土壤镉污染对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）和加州腔蚓（Metaphire californica）体表角质层的影响

张慧琦，王坤，岳士忠，乔玉辉*

中国农业大学资源与环境学院，北京 100193

利用镉（Cd）污染土壤（0.15、7.28、13.53、16.45 mg∙kg-1）在室内培养赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）和采集野外原位污染（0.84、2.17、5.16、6.38、9.83 mg∙kg-1）土壤中的加州腔蚓（Metaphire californica），使用JEM-1230型透射电镜观察不同质量分数Cd污染土壤对赤子爱胜蚓与加州腔蚓体表角质层超显微结构的影响，分析其与土壤中Cd的关系，探寻其在Cd污染条件下的变化规律，并对蚯蚓体壁在防御重金属毒性中的作用进行初步研究，旨在揭示 Cd长期污染条件下蚯蚓的生态适应性，为正确地开展土壤污染生态风险评价提供科学依据。研究结果表明，在Cd低污染条件下赤子爱胜蚓（Cd＜7.28 mg∙kg-1）和加州腔蚓（Cd＜5.16 mg∙kg-1）上角质层突起（微绒毛）排列较为整齐有序，在Cd高污染条件下其上角质层突起变得稀疏无序，并且污染严重时会出现颗粒化或缺失现象。赤子爱胜蚓和加州腔蚓的角质层均随着土壤Cd质量分数及蚯蚓体内Cd的质量分数的升高呈现出先增厚后变薄的变化规律，且在各处理条件下都能正常生存。由此可知，在Cd污染土壤中，不同种的蚯蚓可以通过调节角质层厚度来适应受污染的土壤环境。

镉；蚯蚓；角质层；超显微结构

土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，也是生态环境的重要组成部分，而人类活动造成的土壤重金属污染已经严重影响了生态环境（Zhao et al.，2015；周杨，2015）。土壤重金属污染的生态风险评价和污染修复治理已成为环境研究领域的热点。有毒有害污染物在生态系统中的生态过程与毒理效应研究是准确识别污染物环境危害性和进行生态风险评价的基础。目前绝大多数评估通常采用实验室高浓度、短时间的急性毒性试验数据，而在长期污染条件下，生物通过自身的生理生化调整适应了这种污染的环境，因而如果不考虑生物适应性，往往会出现风险高估的情况（章海波等，2007）。

蚯蚓作为土壤污染风险评价的重要指示生物，不仅对污染土壤具有净化能力，同时在土壤重金属污染的生态风险评价中也起着重要的作用（Eijsackers et al.，2005）。近年来研究发现，即使在较高污染地区也存在着优势种蚯蚓，表明蚯蚓对重金属污染土壤环境具有较强的适应性（袁方曜等，2004；金亚波等，2009；唐浩等，2013；Lévêque et al.，2015），但其对重金属毒害的适应机理尚不清楚。蚯蚓体壁是抵御外界土壤污染的第一屏障，蚯蚓体表角质层主要是由上角质层突起、上角质层、胶原纤维和穿过其间的微绒毛构成；可以抵抗外源污染物质的毒害（Gao et al.，2008；李辉龙等，2011）。生存在重金属污染土壤中的蚯蚓，其体表组织能够直接接触土壤。环境中重金属或农药以及大肠杆菌等外源污染物质可能对蚯蚓体壁的结构和功能产生影响（高玉红，2007；袁方曜等，2004）。但是由于蚯蚓的习性和生存环境的嗜性不同，不同种蚯蚓体壁的超微结构也有细微差异（肖亿群等，2002；Anderson et al.，1967；Burke，1974；Jamieson，1982）。

目前大部分相关研究都是在实验室人为往土壤中添加重金属的条件下，开展关于蚯蚓的急性或亚急性毒性方面的研究（郭永灿等，1996；吴波等，2011），通常采用急性毒性实验研究赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）短期内的应激反应，而在长期污染的野外条件下，蚯蚓是否能够通过自身的生理生化调整来适应这种污染的环境，有关这方面的研究还比较少（窦晶晶，2015，肖亿群等，2002）。本研究利用镉（Cd）污染地区的原位污土在实验室进行培养，利用透射电子显微镜观察生态毒理试验常用的赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的角质层超显微结构，与生存于湖南地区长期重金属Cd污染土壤中的优势种野生蚓——加州腔蚓（Metaphire californica）的角质层超显微结构变化，分析蚯蚓在镉污染条件下角质层的变化规律，对蚯蚓适应污染土壤环境的机理进行初步探讨，为更好地开展土壤污染生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试蚯蚓

赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）：购于北京市顺义区赤子爱胜蚓的商业养殖场，均为有环带且体型相近、活性相似的成年蚯蚓。

加州腔蚓（Metaphire californica）：在湖南省衡阳市地区附近，取不同重金属污染程度下的活体野生蚯蚓带回实验室，并选取大小相近、活性相似的成年蚯蚓进行试验。

1.2 供试仪器和试剂

透射电镜切片所用仪器和试剂均由中国农业大学生物学院生命科学研究中心的电子显微镜实验室提供。

主要仪器：LEICAUC6型超薄切片机；JEM-1230型透射电镜。

主要试剂：2.5%戊二醛和 1%锇酸、磷酸缓冲液、丙酮、环氧树脂、乙醇。

1.3 试验设置与样品处理

1.3.1 实验设置

在实验室内将赤子爱胜蚓置于原位污染土壤中培养，将取自湖南省衡阳市地区的原位污土与本地清洁土进行配比，本实验共设A：0.15 mg∙kg-1，B：7.28 mg∙kg-1，C：13.53 mg∙kg-1，D：16.45 mg∙kg-1，4个不同质量分数的Cd污染土壤处理（表1），每个处理设 3个重复；培养期间室温保持在23 ℃左右，土壤含水量为最大田间持水量的50%～70%，培养35 d后进行取样。

加州腔蚓（Metaphire californica）取自湖南省衡阳市附近不同污染程度土壤（0.84、2.17、5.16、6.38、9.83 mg∙kg-1），每一个样地随机选取9个小样点，采用手捡法采集蚯蚓，每个样点大小为 50 cm×50 cm×25 cm，同时采集土样，土壤样品装入塑封袋中，风干后研磨过筛（0.15 mm）后分装。

1.3.2 样品及切片处理

每个处理或采样地随机选取3条具有环带且体型、活性相近的成年蚯蚓进行24 h清肠处理，并用去离子水将体表洗净，然后用15%酒精麻醉，75%酒精杀死，保存于90%酒精中；送到中国农业大学生物学院生命科学研究中心的电子显微镜实验室进行切片处理，切片取材位置位于蚯蚓环带后 1～2 cm处。

表1 赤子爱胜蚓的上角质层厚度变化Table 1 The change of Eisenia fetida cuticles′s thickness

切片处理：将所取样品用2.5%戊二醛固定2 h后用0.1 mL磷酸缓冲液冲洗3次，再用1%锇酸固定2 h，0.1 mL磷酸缓冲液冲洗3次，分别用30%、50%、70%、90%、100%丙酮梯度水脱水3次，随后用环氧树脂SPURR包埋、聚合，LEICA UC6型超薄切片机切片，醋酸双氧铀、柠檬铅双染色，最后在透射电子显微镜室，用JEM-1230透射电镜观察并拍照。

1.3.3 蚯蚓及土壤重金属测定

经过24 h清肠后，测定蚯蚓体内重金属Cd含量，使用HNO3-H2O2消化炉消解，土壤使用王水（V硝酸∶V盐酸=1∶3）微波消解（MARS-5，CEM Microwave Technology Ltd，Matthews，NC，USA)，ICP-MS 测定（ICP-MS，7700ce，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）。

2 结果与讨论

2.1 赤子爱胜蚓对Cd的吸收累积

在不同质量分数的Cd污染土壤中，随着培养时间的增加（图1），赤子爱胜蚓的活性和活动能力都逐渐下降，但在第5次（35 d）取样时并没有出现死亡现象。并且随着培养时间的增加，对照处理A（0.15 mg∙kg-1）赤子爱胜蚓体内 Cd的质量分数未出现明显升高；而其他各处理赤子爱胜蚓体内Cd的质量分数随着培养时间的增加呈明显的上升趋势。虽然其他处理中赤子爱胜蚓体内Cd的质量分数相对于A（CK）处理都有明显升高，但是相对的富集能力变化并不明显，其富集系数分别为B处理0.86、C处理0.83、D处理0.50；随着土壤中Cd质量分数的升高，赤子爱胜蚓对Cd的富集能力有所下降，这很可能与赤子爱胜蚓对土壤中Cd的毒性产生适应后，调节自身的生理结构和生化活动来降低自身对Cd的富集作用有关。因此，本研究将从蚯蚓体壁超显微结构的角度进行分析探究。

图1 赤子爱胜蚓在Cd质量分数不同的污染土壤中体内Cd的质量分数随培养时间的变化Fig. 1 The mass fraction of Cd in Eisenia fetida living in different Cd mass fraction of soil varies with time

2.2 重金属Cd对赤子爱胜蚓角质层超显微结构的影响

在不同质量分数Cd污染土壤中培养35 d后对赤子爱胜蚓进行取样观察，各处理赤子爱胜蚓的上角质层和超显微结构如表1和图2所示。通过透射电镜观察发现：各处理蚯蚓上角质层突起的稀疏程度随土壤中Cd质量分数的变化而出现差异，甚至在处理 C、D中上角质层突起与上角质层的连接处出现断裂现象；处理A中赤子爱胜蚓的上角质层突起排列整齐规律，而当土壤中Cd质量分数升高为7.28 mg∙kg-1时，上角质层突起出现了少量的断裂缺失的现象（图2B）；随着土壤中Cd质量分数进一步升高时，上角质层突起的损伤程度较为严重，出现颗粒化或缺失现象（图2C、图2D）。

图2 Cd质量分数不同的土壤中赤子爱胜蚓的体表超显微结构Fig. 2 The ultramicroscopic structure of Eisenia fetida cuticle within different mass fraction of Cd pollution soil

观察赤子爱胜蚓角质层的超显微结构，对照处理A赤子爱胜蚓的上角质层厚度为1.63 μm，暴露在不同质量分数Cd污染土壤下后，赤子爱胜蚓的上角质层显微结构出现明显的变化（图2中粗箭头所在位置）；不同处理赤子爱胜蚓角质层平均厚度分别为 B：2.04 μm；C：1.85 μm；D：1.42 μm，最大增幅达到144%（B）。处理B、C赤子爱胜蚓的上角质层厚度显著大于对照处理，而处理D赤子爱胜蚓的上角质层厚度显著小于对照处理，且随着土壤中和蚯蚓体内Cd质量分数的增加，赤子爱胜蚓的上角质层出现先增厚后变薄的变化。

2.3 重金属Cd对加州腔蚓角质层超显微结构的影响

在不同质量分数Cd污染土壤下，加州腔蚓角质层的超显微结构具有与赤子爱胜蚓相似的变化规律（表2和图3）。随着土壤中Cd质量分数的升高，加州腔蚓上角质层突起（细箭头）排列的整齐程度呈现出与赤子爱胜蚓相似的变化：图3a（0.84 mg∙kg-1）显示加州腔蚓的上角质层突起排列整齐且更为紧密，但是随着土壤Cd质量分数的进一步升高（Cd＞5.16 mg∙kg-1），各采样点下加州腔蚓的上角质层突起出现不同程度的缩短和稀疏无序的现象，甚至有些地方出现断裂（图 3d、3e）或颗粒化（图3c）现象。

表2 加州腔蚓的体表角质层厚度变化Table 2 The change of Metaphire californica cuticles′s thickness

通过观察分析加州腔蚓的角质层超显微结构，还发现不同质量分数Cd污染土壤中加州腔蚓的上角质层厚度（图3中粗箭头所在位置）也有所不同，除b处理中加州腔蚓的上角质层厚度（1.49 μm）小于比对照处理（1.71 μm）外，其他处理的平均厚度分别为c处理：2.76 μm；d处理：1.93 μm；e处理：1.79 μm，最大增幅达 185%（处理 c）。处理 c、d加州腔蚓的上角质层显著厚于对照处理，且随着土壤Cd质量分数的升高，加州腔蚓上角质层同样出现先增厚后变薄的变化。

2.4 讨论

蚯蚓对重金属有一定的耐受和富集能力，Dai et al.（2004）研究表明，蚯蚓对诸如镉、铅、锌等重金属都有富集作用，并且蚯蚓组织中污染物的浓度和土壤中的浓度有一定的相关性；而耐受性表现为在一定水平的干扰因子影响下生存的相对能力，在生物学评价中起着重要作用。蚯蚓通过皮肤吸收，富集土壤中的营养和污染物质。在这一过程中，蚯蚓体壁结构的变化对蚯蚓体表吸收或拦截土壤污染物质具有重要作用。而体壁结构中上角质层的主要成分是酸性多糖，它对于保护动物机体抵抗外源物质的入侵具有重要作用，上角质层变薄说明了其结构受到了破坏，机体的防御机能下降（吴波，2010）。当蚯蚓暴露在不同质量分数Cd污染土壤中，体表角质层结构的变化反映了蚯蚓对Cd的防御性反应。

蚯蚓对重金属的反应因蚯蚓的品种不同而有所差异。有些蚯蚓品种对重金属很敏感，比如赤子爱胜蚓就对土壤镉污染很敏感（王慧等，2008）；但是赤子爱胜蚓适应大田环境时，可能会由于其生理结构的变化使其对重金属的耐受性改变，袁方曜等（2004）对华北地区农田环境有害化学物质对蚯蚓群体构成的影响进行了调查，并做了重金属毒理试验，结果显示赤子爱胜蚓等蚯蚓种是适用于积累指示的重金属污染耐受性蚯蚓种。因此，要准确判断Cd对蚯蚓角质层超显微结构的影响，应综合考虑室内培养试验和野外重金属耐受性蚯蚓的变化规律。

本研究发现，当土壤中重金属Cd对蚯蚓的上角质层厚度产生影响时，赤子爱胜蚓上角质层突起也会出现一些适应性变化。主要表现为随着土壤中Cd质量分数的不断升高，赤子爱胜蚓上角质层突起会由整齐有序的状态变为稀疏无序或颗粒化状态，严重时出现缺失的现象。这可能和细胞中的大颗粒细胞、小颗粒细胞和网状粘液细胞等分泌的蛋白或粘液量有关（高玉红，2007；Gao et al.，2008）。本研究主要观察了赤子爱胜蚓和加州腔蚓的体表上角质层厚度和上角质层突起的变化，而其细胞内的溶酶体和内质网等其他细胞器或细胞器结构在受到重金属污染时是如何变化的，还需进一步试验验证。

图3 Cd质量分数不同的土壤中加州腔蚓体表超显微结构Fig. 3 The ultramicroscopic structure of Metaphire californica cuticle within different mass fraction of Cd pollution soil

本研究发现重金属Cd能够影响蚯蚓角质层的超显微结构。不同污染条件下，蚯蚓的上角质层厚度出现规律性的变化。在Cd质量分数相对较低的土壤中，无论是室内培养的赤子爱胜蚓，还是原位污染土中的加州腔蚓，其上角质层均明显加厚，但随着土壤中Cd质量分数的不断升高，当其超出蚯蚓的耐受能力后又出现变薄的现象，这与高玉红等（2008）研究兽药阿苯哒唑对蚯蚓皮肤和肠道超显微结构的影响结果相似，当蚯蚓暴露于100 mg∙kg-1兽药阿苯哒唑时，其皮肤角质层增厚，而在 600 mg∙kg-1时角质层变薄。分析加州腔蚓的变化规律时发现b处理中上角质层比对照处理中更薄，在正常生长发育过程中，除土壤中Cd对加州腔蚓的角质层结构有影响外，土壤中其他环境因素（如有机质含量等）以及机体自身的调整能力（如体内酶活性等）都对其有一定的影响，所以，还需进一步实验分析。

另外，蚯蚓上角质层加厚，可能是蚯蚓体在真正受Cd毒性影响前的一种自身适应机制，其能够通过上角质层的增厚，增强土壤Cd接触或进入蚯蚓皮肤的阻力，从而降低蚯蚓对Cd的吸收，并且不需要消耗更多的机体能量；当土壤中Cd浓度或蚯蚓体所富集的Cd浓度超过了蚯蚓能够调节、抵抗的阈值时，机体的适应系统可能会遭受破坏，蚯蚓需消耗更多的机体能量来抵抗Cd毒害作用，故上角质层变薄。诸多学者在研究其他污染物对蚯蚓的毒性试验时发现了相似的现象（郭永灿等，1996；肖亿群等，2002；高玉红，2007；Gao et al.，2008；李辉龙等，2011），并且蚯蚓体内相关酶（如过氧化氢酶CAT）活性的变化波动也较大，说明蚯蚓在受到干扰时，机体能够频繁地调整以尽量清除体内的自由基等有害物质，从而适应新的污染环境（唐浩等，2017）。

因此，角质层的加厚可能是重金属Cd对蚯蚓的正常生活产生影响前蚯蚓进行自身调节的防御机制，但是当土壤中Cd质量分数或体内富集的重金属Cd质量分数超过自身的耐受或调节能力后，机体的防御系统就会受到破坏，导致角质层变薄。然而，引起角质层变化的具体机理还需要进一步验证与研究。

3 主要结论

（1）低镉污染土壤条件下，赤子爱胜蚓和加州腔蚓均出现整齐有序的上角质层突起（微绒毛），在高镉污染土壤条件下，角质层变薄呈无序排列，并且污染程度严重时会出现断裂缺失现象。

（2）赤子爱胜蚓和加州腔蚓的角质层随着土壤中Cd质量分数的升高均出现先增厚后变薄的变化规律，且随着蚯蚓体内Cd的累积变化，角质层亦表现为先增厚后变薄的规律。

上角质层厚度的变化可能是蚯蚓在Cd污染土壤中通过自我调节形成的一种适应机制，这种调节机制在蚯蚓对Cd毒性的耐性中所起到的作用还需进一步研究。

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The Impact of Soil Cadmium on the Ultrastructural Cuticle of Two Earthworms Species Eisenia fetida and Metaphire californica

ZHANG Huiqi, WANG Kun, YUE Shizhong, QIAO Yuhui
College of Resources and Environment Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China

In this study Eisenia fetida was cultivated and exposed to cadmium (Cd) contaminated soils with mass fraction of 0.15,7.28, 13.53, 16.45 mg∙kg-1and Metaphire californica was sampled from historic cadmium (Cd) contaminated areas with mass fraction of 0.84, 2.17, 5.16, 6.38, 9.83 mg∙kg-1in Huanan Province. The toxic effect of cadmium (Cd) on the ultrastructural cuticle of two earthworms species was studied with transmission electron microscope (TEM). The relationship was analyzed between the variety of earthworm’s ultrastructural cuticle and the mass fraction of Cd in soil, in order to study the variation of the earthworm’s ultrastructural cuticle in Cd-contaminated soil, and the influence of heavy metal on earthworm cuticle. The aim of this study was to reveal the ecological adaptability of earthworms in long-term pollution soils and of Cd, and to provide the scientific basis for evaluating ecological risk of polluted-soil correctly. The results showed that the up-cuticle protuberances (microvilli) in earthworms appeared orderly under low soil Cd pollution(Cd＜7.28 mg∙kg-1) for Eisenia fetida and Cd＜5.16 mg∙kg-1for Metaphire californica.They became sparse and disordered and even disappeared, with the increase of Cd pollution in soil. Meanwhile, the cuticle thickness increased with soil Cd pollution both in Eisenia fetida and Metaphire californica. However, it indicated decreased tendency with relative high soil Cd pollution, and there were no deaths in the Cd contaminated soils. The change of ultrastructural cuticle would be one mechanism of earthworms to adapt to Cd contaminated soil.

cadmium; earthworm; cuticle; ultrastructure

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.10.023

X171.5

A

1674-5906（2017）10-1807-07

张慧琦, 王坤, 岳士忠, 乔玉辉. 2017. 土壤镉污染对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）和加州腔蚓（Metaphire californica）体表角质层的影响[J]. 生态环境学报, 26(10): 1807-1813.

ZHANG Huiqi, WANG Kun, YUE Shizhong, QIAO Yuhui. 2017. The impact of soil cadmium on the ultrastructural cuticle of two earthworms species Eisenia fetida and Metaphire californica [J]. Ecology and Environmental Sciences, 26(10): 1807-1813.

国家自然科学基金项目（41471410）

张慧琦（1991年生），男，硕士研究生，研究方向为污染生态。E-mail: zhq_cau@foxmail.com; 1126561498@qq.com

*通信作者：乔玉辉，副教授，博士生导师，主要研究方向为土壤污染生态。E-mail: qiaoyh@cau.edu.cn

2017-07-06