柱前衍生化法结合HPLC测定2-哌啶乙醇对映体光学纯度

(泸州市江阳区环境保护监测站，四川泸州，646000)

分析与测试

柱前衍生化法结合HPLC测定2-哌啶乙醇对映体光学纯度

张君筠
(泸州市江阳区环境保护监测站，四川泸州，646000)

用3，5-二硝基苯甲酸对2-哌啶乙醇进行柱前衍生，将其衍生物在Chiralcel OD-H手性固定相上拆分，建立了一种拆分2-哌啶乙醇消旋体、测定2-哌啶乙醇光学纯度的新方法。以正己烷与乙醇或异丙醇为流动相，在Chiralcel OD-H手性固定相上对2-哌啶乙醇衍生物进行了拆分，并考察了流动相组成、柱温和流速对该对映体分离的影响，获得较优分析条件，分析时间在15分钟内，分离度大于1.7。结果表明，2-哌啶乙醇衍生物对映体在正己烷-乙醇(体积比85:15)为流动相、流速为1.0 mL min-1、柱温为 30℃时，分离效果最佳。本方法操作简单、重现性好，可用于2-哌啶乙醇对映体的质量控制。

高效液相色谱法 2-哌啶乙醇 柱前衍生化 对映体拆分

2-哌啶乙醇分子中含有氨基和羟基等活性官能团，因此在分子多样化构建方面具有巨大的开发应用价值。Scalacci等人以2-哌啶乙醇为原料合成出了一系列具有对抗耐药结核活性的新型硫利达嗪衍生物[1]；Kwon等人用2-哌啶乙醇合成了一系列具有抗肿瘤活性的磺胺类药化合物[2]；Chausset-Boissarie等人应用不对称合成反应合成出了(+)-vertine和(+)-lythrine[3]。此外，2-哌啶乙醇其哌啶环上有一个不对称碳原子因而具有两种对映体构型。2-哌啶乙醇单一对映体在药物合成中有着广泛应用，如细胞周期蛋白依赖性激酶SCH727965的合成就是采用(S)-2-哌啶乙醇作为原料[4]；Zanka等人使用(R)-2-哌啶乙醇作为原料合成了一系列新型的非嘌呤腺苷A1受体拮抗剂[5]。随着2-哌啶乙醇单一对映体需求量的增加，在2-哌啶乙醇不对称反应研究及药物生产的质量监控中，对其进行有效的手性拆分和准确光学纯度测定具有非常重要的意义。目前国内外对2-哌啶乙醇的高效液相色谱拆分还未见报道。因此，探索其对映体纯度分析检测方法具有重要意义。手性固定相 HPLC法具有专属性强、分离效率高、测定灵敏度高、分析速度快等优点，可以准确测定手性对映体光学纯度[6,7]。前期研究表明2-哌啶乙醇在传统手性固定相无法直接拆分，且其紫外吸收较弱，因此本文将2-哌啶乙醇对映体进行非手性试剂衍生化处理。本研究采用Chiralcel OD-H手性色谱柱，建立了2-哌啶乙醇对映体纯度的检测方法，该方法快速、重复性好，适用于生产上的质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-M20A检测器(日本岛津公司)；ClassVP色谱工作站、HCT-360型柱温箱(天津恒奥科技发展有限公司)；KQ5200型超声脱气机(昆山市超声仪器有限公司)。正己烷、异丙醇、乙醇(色谱纯)购买于美国Fisher试剂公司；(±)-2-哌啶乙醇、(R)-2-哌啶乙醇购买于萨恩化学技术(上海)有限公司；3,5-二硝基苯甲酸、N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)均购买于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralcel OJ-H(250mm×4.6mm，Daicel Chemical Industries，LTD公司)；流动相使用前用0.45μm滤膜过滤并超声脱气30min；流速均为1.0 mL min-1；检测波长254nm；柱温20～40℃。测定样品用流动相溶解；进样量为10μL；死时间以乙醇测定。

1.3 样品衍生化处理

用3,5-二硝基苯甲酸将2-哌啶乙醇衍生化：称取0.13mL(1mmol)2-哌啶乙醇于10mL二氯甲烷中，称取0.247g(1.2mmol)DCC溶于上述二氯甲烷中，此混合物在室温下搅拌反应5分钟。最后加入0.212g(1mmol)3,5-二硝基苯甲酸进行反应，温度30℃，反应式见图1。将反应得到的粗品，依次用1mol/L的盐酸、1mol/L的氢氧化钠，水洗涤后用无水硫酸钠干燥，过滤，再浓缩得产品。

图1 2-哌啶乙醇的衍生化反应

2 结果与讨论

2.1 手性固定相的选择

本实验考察了三种手性色谱柱对2-哌啶乙醇衍生物对映体分离效果，在流动相组分比例为正己烷：异丙醇=80：20(V/V)的条件下，采用Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralcel OJ-H对2-哌啶乙醇衍生物进行拆分，实验发现只有Chiralcel OD-H色谱柱可以实现2-哌啶乙醇衍生物对映体的分离。故本实验采用Chiralcel OD-H对2-哌啶乙醇衍生物对映体拆分，并进一步考察流动相组分、温度、流速对分离效果的影响，优选出最佳分离条件。

2.2 流动相组成对分离的影响

以正己烷作为流动相分别加入异丙醇和乙醇调节极性强度，以获得最佳峰间距和分离效果。使用Chiralcel OD-H测定不同流动相极性下2-哌啶乙醇衍生物的拆分情况，其中流速为1.0mL min-1，柱温为30℃的结果列于表1。流动相极性的微小变化，对于对映体保留时间有较大的影响。实验表明，乙醇做流动相极性调节剂时，分离效果比异丙醇做流动相极性调节剂要好。从表1中的实验结果可以看出，当正己烷：乙醇=85：15(V/V)时，两个峰既实现了基线分离、出峰时间较短、总的分析时间小于15分钟，分离度也较高，这是最适合分析使用的条件。在流动相为正己烷：乙醇=85：15(V/V)，流速为1.0mL min-1，柱温为30℃的HPLC条件下，Chiralcel OD-H对2-哌啶乙醇衍生物对映体的分离情况见图2。从图2可以看出，两个对映体峰分别检测出，且R构型衍生物被优先洗脱下来。

表1 流动相组成对分离效果的影响

Hex代表正己烷；IPA代表异丙醇；EtOH代表乙醇。t1为第一个峰的保留时间；t2为第二个峰的保留时间；k1为第一个峰的保留因子；k2为第二个峰的保留因子。

2.3 柱温对分离度的影响

流动相为正己烷：乙醇=85：15(V/V)，流速为1.0mL min-1下，考察了不同柱温对保留时间、分离因子、分离度的影响，结果显示：随着柱温升高，保留时间缩短，分离因子无显著变化，而分离度有所降低。但考虑到低温时保留时间较长，延长了分析时间。因此，选择温度为30℃，是适合于分析所使用的条件。

图2 2-哌啶乙醇衍生物色谱图

2.4 流速对分离的影响

流动相为正己烷：乙醇=85：15(V/V)，柱温为30℃条件下，考察了不同流速对保留时间、分离因子以及分离度的影响。结果表明：当流速从0.6mL min-1升至1.2mL min-1时，该对映体的分离度、保留时间相应减小，但分离因子几乎不变。结果表明改变流速不能显著提高手性选择性，但是降低流速导致了分离度的增加，这是因为该对映体的分配系数比较接近，较小的流速促使对映体在固定相和流动相之间的分配作用次数增多，使得该对映体分离效果更好。从分离度数值来看，在所选的各流速下均达到了较好分离，过大的流速会导致柱压过高，致使色谱柱的使用寿命缩短。过小的流速会使峰展宽增大，分析时间过长。因此我们选择1.0mL min-1为最佳流速。

2.5 线性关系、检出限和精密度

2-哌啶乙醇衍生物浓度在40～500 μg/mL的范围内，标准曲线有良好的线性，标准曲线为y1=142156x1+1471和y2=134756x2+1247 (y1为R-构型衍生物峰面积，x1为R-构型衍生物浓度；y2为S-构型衍生物峰面积，x2为S-构型衍生物浓度)，回归系数分别为0.9996和0.9994。逐渐稀释至色谱峰信噪比接近3时，得到2-哌啶乙醇衍生物的检测限分别为147μg/mL(R-构型衍生物)和134μg/mL(S-构型衍生物)。连续9次进行平行测定，相对标准偏差(RSD)在1.28%以内，说明精密度很好。

2.6 样品稳定性

样品溶解在正己烷：乙醇=85：15(V/V)的流动相中，在室温下保存。分别于0、2、4、6、8、24h取样检测并记录色谱图，图中未发现有其他杂质峰，作为目标组分的对映体的保留时间、分离度基本保持不变，峰面积的RSD分别为0.35%和0.71%。24h内该溶液一直保持澄清透明，且无沉淀等析出。说明该样品在室温条件下及选定的色谱条件下稳定性好。

3 结论

本文使用柱前衍生结合手性固定相法实现了2-哌啶乙醇对映体的分离，并考察了流动相组成、柱温、流速等因素对拆分效果的影响，得到了以下最优分离条件：正己烷：乙醇=85：15(V/V)为流动相，在流速为1.0mL min-1, 柱温30℃，检测波长为254nm的条件下，2-哌啶乙醇衍生物对映体的分离度达1.71。本文建立的分析方法简便快速、重复性好，可为手性2-哌啶乙醇的合成及质量控制提供准确可靠的检测方法。

[1] Scalacci N, Brown A K, Pavan F R, et al. Synthesis and SAR evaluation of novel thioridazine derivatives active against drug-resistant tuberculosis[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, 127: 147-158.

[2] Kwon Y, Song J, Lee H, et al. Design, Synthesis, and Biological Activity of Sulfonamide Analogues of Antone and Cryptopleurine as Potent and Orally Active Antitumor Agents[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 58: 7749-7762.

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[4] Paruch K, Dwyer M P, Alvarez C, et al. Discovery of Dinaciclib (SCH 727965): A Potent and Selective Inhibitor of Cyclin-Dependent Kinases[J]. ACS Medicinal Chemistry Letters, 2010, 1: 204-208.

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[7] Zhang T, Liao M, Tian, Y, et al. HPLC Determination of Enantiomeric Purity of Letermovir Based on CHIRALPAK AD[J]. Journal of Chromatographic Science, 2016, 54: 1495-1500.

DeterminationofEnantiomericPurityfor2-PiperidineethanolbyHPLCCombiningwithPre-ColumnDerivation

ZhangJunjun
(EnvironmentalProtectionMonitoringStationOfJiangyangDistrictLuzhou,Luzhou646000,Sichuan,China)

The 2-piperidineethanol was derivatized with 3,5-dinitrobenzoic acid that was the reagent of pre-colume derivatization of high performance liquid chromatography, and the derivative was separated by Chiralcel OD-H chiral stationary phase. A method for separating the racemate and determining the enantiomeric purity of 2-piperidineethanol was established. Chromatographic model was employed for enantiomeric separation of 2-piperidineethanol derivatives on the Chiralcel OD-H chiral colume in hexane/alcohol (ethanol or isopropyl alcohol) mobile phase. The effects of chromatography conditions, such as mobile phase, temperature and flow rate to chiral recognition, had been investigated. A better condition of analysis was obtained within a short run time of less 15 min. The resolution were more than 1.7. The results indicated that a good separation was obtained at 30℃ by using hexane-ethanol (85:15, V/V) as the mobile phase with a flow rate of 1.0 mL min-1. The presented study provided a simple and reproducible method for the enantiomeric quality control of 2-piperidineethanol.

high performance liquid chromatography; 2-piperidineethanol; pre-colume derivatization; enantioseparation