应用高效液相法测定北五味子不同部位和不同炮制品中五味子醇甲的含量※

初洪波 车 燚 李海涛 谢晓燕

应用高效液相法测定北五味子不同部位和不同炮制品中五味子醇甲的含量※

初洪波 车 燚 李海涛 谢晓燕*

（长春中医药大学附属医院中医药研究中心，长春 130021）

目的 应用高效液相法测定北五味子不同部位和不同炮制品中五味子醇甲的含量，探讨五味子炮制时采用不同的方法对五味子醇甲含量的影响。方法 测定五味子醇甲含量时的流速为1.0 mL/min，色谱柱为岛津WondaCract ODs-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长为250 nm；采用梯度洗脱的方法，流动相A为甲醇，流动相B为水。结果 原药材（北五味子）、果肉、果核等不同部位中五味子醇甲含量为6.11 mg/g、4.23 mg/g、8.13 mg/g；未粉碎和粉碎的醋制炮制品中五味子醇甲含量为7.56 mg/g、7.73 mg/g，未粉碎和粉碎的酒蒸炮制品中五味子醇甲含量为含量为7.61 mg/g、7.82 mg/g。结论 醋制、酒蒸等不同的手段均可明显提高炮制品中五味子醇甲含量，结合粉碎的方法可使五味子醇甲含量更高。关键词：北五味子；五味子醇甲；炮制；含量测定

北五味子的主产地为长白山地区，是吉林省道地药材。敛肺滋肾、止泻涩肠是其主要的功效， 收载于各家本草中，均列为上品。主要的临床适应症为失眠、神经衰弱、慢性肝炎和肺虚久咳等，具有解热镇静、镇痛镇咳的药理作用，可明显延长睡眠时间。为了保证临床效果，五味子需要经过炮制，常见的炮制方法有醋制和酒蒸，其炮制品分别为醋五味子和酒蒸五味子[1]。北五味子药典收载的功效物质为五味子醇甲[2]，笔者对原药材（北五味子）、果肉、果核及不同炮制品的功效成分进行了测定，以期确定最佳的炮制工艺。本研究采用高效液相法建立了北五味子原药材、果肉、果核及醋制品、酒蒸制品中五味子醇甲含量测定方法[3-16]。现就原药材、果肉、果核及不同炮制品中功效物质（五味子醇甲） 的含量比较研究报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相仪（岛津LC-2010A型），Lab solution数据工作站，岛津紫外检测器， 电子分析天平（塞多利斯CP225D型，d=0.01mg），KQ-100型超声波清洗器。

1.2 试剂和试药 北五味子购自长春市玺康药业，经吉林省中医药科学院南敏伦教授鉴定，为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。五味子醇甲（规格：20 mg，供含量测定用，批号：110857-201410，购于中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其它试剂皆为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 按表1中的比例采用梯度洗脱的方法，流动相A为甲醇，流动相B为水；检测波长为250 nm。流速：1 mL/min，柱温：室温。色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶（4.6 mm×250 mm，5 μm）；五味子醇甲峰的理论板数应≥3000[17]。

表1 梯度洗脱表

2.2 对照品溶液制备 取样量：五味子醇甲约3 mg，精密称定；制备容器和方法：置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[18]。

2.3 供试品溶液的制备 样品取样的要求：取通药材粉末（过三号筛） 约0.3 g，精密称定； 制备容器和方法：置25 mL量瓶，加甲醇约18 mL，超声处理30 min，超声完成后，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得[19-20]。

2.4 五味子不同炮制方法样品的制备[2]生五味子：除去杂质和果柄，洗净，干燥；五味子果肉、果核：取生五味子，用水润透，把果核、果肉分离，备用；醋制炮制品1:生五味子以比例 （米醋∶五味子=20∶100） 拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60℃干燥；醋制炮制品2：过20目筛原药材粗粉，以比例（米醋∶五味子=20∶100） 拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60 ℃干燥；酒蒸炮制品1：生五味子以比例（黄酒∶五味子=20∶100） 拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60℃干燥；酒蒸炮制品2：过20目筛原药材粗粉，以黄酒∶五味子=20∶100的比例加入黄酒拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60℃干燥。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性 五味子醇甲溶液、生五味子供试品溶液、溶剂（甲醇）各10 μL，精密吸取，注入液相色谱仪，目标峰（五味子醇甲）与其它峰有较好的分离度，溶剂在相应位置无干扰。方法专属性良好。色谱图见图1～3。

图1 对照品高效液相谱图

图2 生五味子供试品溶液高效液相谱图

图3 甲醇溶液谱图

2.5.2 线性关系考察 对照品溶液2.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0 μL，精密吸取，注入液相仪测定，横坐标为进样量（μg），纵坐标为峰面积积分值，绘制标准曲线，见图4。回归方程：y=2070585.2471x+22107.8173，r=1.0000，五味子醇甲线性范围为0.6200～6.2000 μg，试验结果见表2，对照品溶液进样量与峰面积的线性关系良好。

图4 对照品标准曲线

表2 线性关系考察

2.5.3 耐用性试验

2.5.3.1 流速的考察 为了考察不同流速对试验结果的影响程度，我们选择0.8 mL/min，1.0 mL/min，1.2 mL/min进行试验，结果表明其塔板数、分离度均达到要求。

2.3.3.2 柱温考察 为了验证方法，考察柱温的高低对色谱峰分离效果的影响，我们选择20℃，25℃，30℃，进行试验，结果表明其塔板数、分离度均达到要求。

2.5.3.3 不同色谱柱的考察 为了考察不同厂家的色谱柱对色谱峰分离度的影响，我们选择不同品牌的色谱柱进行试验，结果表明其塔板数、分离度均达到要求。

经过对流速、柱温和不同品牌色谱柱的考察试验，说明试验条件的小变动对我们设计的系统适用性试验影响不大，所以我们选择的方法有效。

2.5.4 稳定性试验 五味子醇甲对照品溶液10 μL，精密吸取，每隔一定时间注入液相色谱仪，考察方法的稳定性（指标为五味子醇甲峰面积积分值），结果见表3。

表3 稳定性试验

稳定性考察结果显示：RSD分别为0.06%，方法具有良好的稳定性，即24 h内测定结果可靠。

2.5.5 精密度试验 五味子醇甲对照品溶液10 μL，精密吸取，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定，记录峰面积积分值，经计算，精密度的结果见表4。

表4 精密度试验

精密度考察结果显示：RSD为0.47%，方法具有良好的精密度。

2.5.6 重现性试验 生五味子同一批样品共6份，精密称取，按供试品溶液项下方法制备，测定，计算，重现性的结果见表5。

表5 重现性试验

以五味子醇甲为测定指标，考察本法的重现性，RSD为0.94%，平均含量为6.11 mg/g，方法具有良好的重现性。

2.5.7 中间精密度试验 生五味子同一批样品共6份，精密称取，按供试品溶液项下方法制备，由不同人员在不同时间依法独立测定，计算样品含量，以考察本法的中间精密度，结果见表6。

表6 中间精密度试验

中间精密度考察结果显示：RSD分别为1.17%，方法具有良好中间精密度。

2.3.8 加样回收率试验样品取样的要求：含量为6.11mg/g的生五味子样品（通过三号筛的粉末）约0.3 g，共6份，精密称定；提取容器：25 mL量瓶；提取方法:分别精密加入浓度0.9 mg/mL五味子醇甲对照品溶液 (甲醇溶解)2 mL，分别精密加入甲醇约23 mL，超声处理30 min。超声完成后，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。测定，计算，试验结果见表7。

表7 回收率试验结果

平均回收率为100.79%，RSD为1.41%，表明准确性较好，方法可行。

2.5.9 含量测定 （1）制备原药材、果肉和果核的供试品溶液，每批2份，对照品、供试品溶液各10 μL，精密吸取，注入液相色仪测定，不同样品中五味子醇甲含量的结果见表8。

表8 生五味子、果肉和果核五味子醇甲含量测定结果（mg/g）

由五味子醇甲含量结果可知，果核中的含量明显高于果肉中的。所以我们推测在炮制前对原药材进行粉碎，能提高炮制品中五味子醇甲含量，更好地保证炮制品的临床疗效。为了验证推测的正确性，我们进行了下面的验证实验。

（2）制备酒蒸炮制品1、酒蒸炮制品2、醋制炮制品1、醋制炮制品2样品的供试品溶液，每批2份，对照品溶液及供试品溶液各10 μL，分别精密吸取，注入液相色仪测定，计算，不同炮制方法样品中五味子醇甲含量的结果见表9。

表9 不同炮制方法的五味子醇甲含量测定结果 （mg/g）

由炮制品中含量可知，无论是酒蒸还是醋制的方法都能明显提高五味子醇甲含量。在炮制前对原药材进行粉碎，更能显著地提高五味子醇甲含量。从药材有效成分的角度确定五味子炮制的最佳工艺，是先把原药材粉碎成20目粗粉，然后进行酒蒸和醋制的炮制。

3 讨论

参考《中国药典》2015年版一部“五味子”项下收载，在保证五味子醇甲分离度好，选用梯度洗脱，使样品中物质尽快出峰。按此法操作，目标物质出峰的保留时间为15 min，具有良好的分离效果[21]。

取对照品溶液，在200～400 nm之间，使用紫外可见分光光度计进行扫描，测得250.12 nm为最大吸收波长，与中国药典2015年版一部“五味子”项下收载的检测波长为250 nm相符合，故选择检测波长250 nm[22]。

笔者对五味子原药材、果肉和果核炮制前后的五味子醇甲含量进行了测定，以期从原药材功效成分角度确定五味子炮制的最佳工艺。本试验通过比较五味子醇甲在原药材、果核、果肉以及醋制炮制品、酒蒸炮制品中的含量差异，结果显示，果核中五味子醇甲含量约为果肉的2倍。炮制前原药材进行粉碎，能够显著提高炮制品中五味子醇甲含量。因此，最终确定醋制五味子炮制品的最佳工艺为：过20目筛原药材粗粉，以比例（米醋∶五味子=20∶100） 拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60℃干燥。酒蒸五味子炮制品的最佳工艺为：过20目筛原药材粗粉，以黄酒∶五味子=20∶100的比例加入黄酒拌匀，闷润120 min，蒸制300 min，60℃干燥。

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Determination on the Content of Schisandrin in Different Processed Products and Different Parts of Schisandra Chinensis Fruits by High Performance Liquid Chromatography

CHU Hongongbo,CHE Yi,LI Haitao,XIE Xiaoyan*
(Traditional Chinese Medicine Research Center,the Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine,Jilin Province,Changchun 130021,China)

Objective Using high performance liquid chromatography to determine the content of Schisandrin in in different processed products and different parts of Schisandra Chinensis Fruits,and to discuss the influence of different processing methods on contents of Schisandrin.Methods The chromatographic column was Shimadzu WondaCract ODs-2,mobile phase A was methyl alcohol and water was mobile phase B,with gradient elution;detection wavelength of the UV detector:250nm.Results The contents of Schisandrin in Schisandra Chinensis Fruits,pulp and seeds were 6.11 mg/g,4.23 mg/g,and 8.13 mg/g.The contents of Schisandrin in wine steaming1,2 and vinegar steaming1,2 Schisandra Chinensis Fruits were 7.56 mg/g,7.73 mg/g,7.61 mg/g,7.82 mg/g.Conclusion The Schisandrin was increased significantly after being processed,which is processed after the pulverization.

Schisandra Chinensis Fruits;Schisandrin;process;content determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.20.064

1672-2779（2017）-20-0147-04

吉林省卫生计生委自筹经费课题【No.2015ZFZ21】

*通讯作者：1194008581@qq.com

2017-06-20）