沙门氏菌CRISPR序列的结构功能与应用研究进展

沈学怀++张丹俊++潘孝成++赵瑞宏++戴银++胡晓苗

摘要 规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）是一类存在于古细菌和细菌基因组内的特殊结构，研究发现沙门菌中存在2个CRISPR位点，该结构不仅参与沙门氏菌对质粒和噬菌体等外源DNA的获得性免疫，同时其序列结构的高度可变性，可作目标基因用以沙门氏菌的基因分型和进化研究。本文综述了沙门氏菌基因组中CRISPR位点的基本结构、作用机制和功能及其在沙门氏菌基因分型和进化研究中的应用进展。

关键词 沙门氏菌；规律成簇的间隔的短回文重复序列；功能；分型；进化

中图分类号 R155.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0236-02

Reasearch Advance on Structure，Function and Application of CRISPR in Salmonella

SHEN Xue-huai ZHANG Dan-jun PAN Xiao-cheng ZHAO Rui-hong DAI Yin HU Xiao-miao

（Institute of Animal and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei Anhui 230031）

Abstract Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRSIPR）are widespread in the genomes of many bacteria and almost archaea.There are two CRSIPR loci located in Salmonella genome，which provide acquired immunity against foreign DNA from plasmid and bacteriophage.Besides，it is suitable as a target gene for genotyping and evolutionary studies of Salmonella due to the multiple structures.In this review，the basic structure，mechanisms and functions of CRSIPR of Salmonella as well as the research progress of CRISPR on bacteria typing and evolution were introduced.

Key words Salmonella；CRSIPR；function；typing；evolution

沙门氏菌（Salmonella）为革兰氏阴性、兼性厌氧、无芽孢的小杆菌，目前发现的有2 600多种血清型，其中绝大部分血清型对动物和人类具有致病性，可通过污染食物引起人类中毒，是重要的人畜共患病原菌[1]。全球每年大约有13亿人因沙门氏菌感染出现急性胃肠炎症状[2]，给人类卫生保健系统造成了严重的经济负担[3]。

CRISPR位点是近年来发现的细菌针对噬菌体等外源基因的获得性免疫系统[4-5]，该结构存在绝大多数古细菌和约40%的细菌的基因组中[6]，研究表明CRISPR位点序列的变化可以使细菌获得对噬菌体等外源DNA的免疫，并且在细菌进化过程中其结构的高度可变性，可以作为细菌分型与进化研究的理想位点[4-6]。沙门氏菌基因组存在2个CRISPR位点，近年来关于沙门氏菌CRISPR位點在细菌分型、菌株溯源和细菌进化等方面的研究也越来越受到关注。

1 沙门氏菌CRISPR 位点结构特点

根据CRISPR 数据库（http：//crispr.u-psud.fr/）中的数据发现沙门氏菌基因组存在 2 个CRISPR 位点，由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）3个部分组成[7]。前导序列位于CRISPR 位点的5′端，大小300～500 bp，富含AT碱基的序列，序列结构保守，与第1个重复序列相连。新序列的插入总发生在前导序列和相邻的基序之间，因而前导序列很可能起着CAS相关蛋白（CRISPR-associated）识别位点的作用，并可能作为CRISPR位点的启动子[4]。重复区序列在CRIPSR位点中相对保守，大小为24～47 bp，在3′末端存在GAAA（C/G）的保守序列，聚类分析显示，一些进化关系很远的原核生物具有相同或相似的重复序列，说明在原核生物间存在CRISPR 的水平转移[7]。重复序列能够形成稳定的发夹结构，其数量与CAS系统的完整程度呈正相关，因而该结构可能是作为CAS蛋白识别标记[8]。间隔区序列与同一位点的重复序列大小相近。最早认为，间隔区序列是细菌等特有的一种结构序列[4]，其后的研究发现，间隔区序列可能自于外源DNA序列（噬菌体或质粒）的插入。Barrangou等用2种噬菌体感染嗜热链球菌，发现在耐噬菌体的嗜热链球菌的CRISPR结构中，临近前导序列末端出现了新的repeat-spacer序列，并且如果新的插入序列与噬菌体的某段基因序列相同，该细菌就表现出对噬菌体的耐受，而一旦序列改变又会重新敏感[9]。因此，间隔区结构与细菌对噬菌体或质粒等外源DNA的免疫有关。

2 作用机制与功能

2.1 作用机制

细菌CRISPR位点类似于其他生物的免疫系统。当噬菌体或质粒等侵入细菌，CRISPR系统会将与入侵外源DNA的同源片段插入前导序列与第一段重复序列之间，同时复制一个新的重复区，形成新的repeat-spacer单元，以插入后的CRISPR转录RNA，经加工后与Cas相关蛋白结合，形成Cas/crRNA蛋白复合体，并以crRNA为向导序列找到外源核酸靶序列，进行降解[10]。endprint

2.2 功能

沙門氏菌通过在CRISPR位点插入与外源质粒和噬菌体等相同基因序列的间隔区来抵御入侵。随着环境中噬菌体和质粒等不断进化，会不断有新的外源基因序列插入CRISPR位点，这些新插入的间隔区序列包含细菌所特有的生态学和地理学信息[11]。因而，CRISPR可以看作是沙门氏菌进化记录器，根据CRISPR位点间区序列排列的差异，能够判断不同菌株间的进化关系，并且研究发现沙门菌的CRI-SPR与血清型密切相关，使得人们能够对沙门氏菌进行快速溯源[12]。

3 应用研究

3.1 在细菌基因分型中的应用

随着细菌的进化，在CRISPR位点中不断有新的间隔序列插入和旧序列的丢失，是细菌基因组中进化速度最快的基因元件之一，因而其具有很高的多态性，这种多态性包含细菌所特有的生物学和地理学特征。通过对CRISPR位点的扩增和测序，利用在线工具CRISPR finder（http：//crispr.u-psud.fr/Server/）比对分析间隔序列的组成和排列从而对细菌分型[13]。Fabre等[14]对包括130种血清型的783株沙门氏菌进行CRISPRS分型分析，研究发现CRISPRS分型具有很高的分辨能力，根据CRISPRS位点的大小就能初步对沙门菌进行分型。还可以用分析软件对CRISPRS位点的间隔序列进一步分析，得到更细致的分型结果。检测结果不仅可以把不同血清型菌株区分开，即使对高同源性的肠炎沙门氏菌也具有一定的区分能力，除此之外，其具有耗时更短、自动化程度更高等优点，能够有效区分暴发流行血清型的菌株，是一种较理想的沙门氏菌分型方法[15]。

3.2 基于CRISPR位点发展的其他细菌基因分型方法

不仅可以单独利用CRISPR对细菌进行分型，还可在此基础上进行方法发展和改良，使之具有更好的分辨率和可操作性。Liu等[16]将多毒力基因位点序列分型（MVLST）分型方案与CRISPR分型相结合，形成CRISPR-MVLST分型方法。其将fimH和sseL这2个毒力基因与 CRISPR位点组合，将fimH、sseL、CRISPR1、CRISPR2等4个等位基因组合，形成一个特定等位基因型图谱，作为唯一指定的序列类型（ST）。研究者利用该方法对9种血清型的171株沙门氏菌进行基因分型，发现该分型效果菌均优于CRISPR分型和多位点序列分型（MLST），可作为沙门菌暴发流行时一种重要的分型方法。Shariat等[17]比较了脉冲场凝胶电泳（PFGE）和CRISPR-MVLST 2种方法对84株纽波特沙门氏菌分型的效果，发现二者辛普森指数D值均高于0.95，在实用中可互为补充。Li等[18]选取CRISPR1与CRISPR2靠近5′端的第1个间隔序列结合在一起作为菌株分型的总序列对沙门氏菌进行分型。利用该方法对21种血清型的82株沙门氏菌进行分析，结果显示，虽然该方法弱于传统的CRISPR与PFGE分型，但优于MLST分型，并且不需要对CRISPR全序列图谱进行分析，成本低，操作简单，实用性更强。

3.3 在细菌进化分析中的应用

研究发现，插入间隔序列可让细菌获得抵抗外源DNA入侵的免疫能力，丢失的间隔序列可能是在当前环境中对细菌的生存价值不大，或者是为了避免CRISPR位点太长而产生的一种机制，新旧间隔序列的插入和丢失同时发生，而且新序列的插入总是位于前导序列和其临近的重复序列之间，而丢失的序列通常位于CRISPR位点3′端的尾随序列。因此，CRISPR位点间隔序列的变化记录着细菌的进化历程，并且反映不同菌株之间的亲缘关系[19]。Timme等[20]对156株沙门氏菌基因进行测序，发现CRISPR位点所反映的进化模式与系统进化不同，并且基因的水平转移和共享环境的变化能够对沙门氏菌的分布产生影响。Fricke等[13]对21种血清型的28株沙门氏菌CRISPR位点分析发现，其介导的基因转移不仅能控制细菌短期的表型变化，也介导长期亚型的进化。

4 结语

细菌CRISPR位点多态性不仅反映了细菌与所处环境的相互关系，同样记录了细菌的进化历程，因而CRISPR位点为沙门氏菌细菌的分型和进化分析研究提供了一个适用的目标基因，在细菌的监测、溯源以及流行病学研究等方面具有重要意义，但是目前利用CRISPR位点进行细菌分型的研究数据仍然有限，缺少相应的细菌分型数据库，对CRI-SPR位点功能的研究也多集中在它的防御机制，其是否能像真核细胞中RNAi一样用于基因沉默，是否参与细菌耐药性的产生等方面值得进一步研究。鉴于CRISPR位点的结构特点和特殊的功能，随着研究的深入，相信会有更广阔的应用前景。

5 参考文献

[1] HARRIET W，KIRSTIN R.Salmonella and eggs：from production to plate[J].Int J Environ Res Public Health，2015，12（3）：2543-2556.

[2] MISRA V，MISRA S P，SINGH M K，et al.Prevalence of H.Pylori in pati-ents with gastric cancer [J].Indian Journal of Pathology & Microbiology，2007，50（4）：702-707.

[3] MORIN K H.Food-borne illnesses：a continuing concern[J].MCN：The American Journal of Maternal/Child Nursing，2013，38（2）：120.

[4] BARRANGOU R，FREMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides-acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315（5819）：1709-1712.endprint

[5] SOREK R，KUNIN V，HUGENHOLTZ P.CRISPR-a widespread system-that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J].Nat Rev Microbiol，2008，6（3）：181-186.

[6] GRISSA I，BOUCHON P，POURCEl C，et al.On-line resources for bacte-rial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing[J].Biochimie，2008，90（4）：660-668.

[7] GRISSA I，VERGNAUD G，POURCEL C.The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J].BMC Bioinformatics，2007，8（1）：172.

[8] KUNIN V，SOREK R，HUGENHOLTZ P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J].Genome Biol，2007，8（4）：1-7.

[9] BARRANGOU R，FREMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315（5819）：1709-1712.

[10] RICHTER C，CHANG J T，FINERAN P C，et al.Function and regulation of clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated（Cas）systems[J].Viruses，2012，4（10）：2291-2311.

[11] KUNIN V，HE S，WARNECKE F，et al.A bacterial metapopulation adapts locally to phage predation despite global dispersal[J].Genome Research，2008，18（2）：293-297.

[12] BARRANGOU R，MARRAFFINI L A.CRISPR-Cas systems：prokaryotes upgrade to adaptive immunity[J].Mol Cell，2014，54（2）：234.

[13] FRICKE W F，MAMMEL M K，MCDERMOTT P F，et al Comparative genomics of 28 Salmonella enterica isolates：evidence for CRISPR med-iated adaptive sublineage evolution[J].Journal of Bacteriology，2011，193（14）：3556-3568.

[14] FABRE L，ZHANG J，GUIGON G，et al.CRISPR typing and subtyping for improved laboratory surveillance of Salmonella infections[J].PLoS One，2012，7（11）：36995.

[15] FABRE L，HELLO S L，ROUX C，et al.CRISPR Is an Optimal Target for the Design of Specific PCR Assays for Salmonella enterica Serotypes Typhi and Paratyphi A[J].PLoS Negl Trop Dis，2014，8（1）：e2671.

[16] LIU F，BARRANGOU R，GERNERSMIDT P，et al.Novel virulence gene and clustered regularly interspaced short palindromic repeat CRISPR

multilocus sequence typing scheme for subtyping of the major serovars of Salmonella enterica subsp enterica[J].Applied and Environmental Micr-obiology，2011，77（6）：1946-1956.

[17] SHARIAT N，KIRCHNER M K，SANDT C H，et al.Subtyping of Salmon-ella enterica serovar Newport outbreak isolates by CRISPR-MVLST and determination of the relationship between CRISPR-MVLST and PFGE results[J].Journal of Clinical Microbiology，2013，51（7）：2328-2336.

[18] LI H，LI P，XIE J，et al.New clustered regularly interspaced short pali-ndromic repeat locus spacer pair typing method based on the newly incorporated spacer for salmonella enterica[J].J Clin Microbiol，2014，52（8）：2955-2962.

[19] HORVATH P，ROMERO D A，CO？譇T？魪-MONVOISIN A C，et al.Divers-ity，activity，and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermoph-ilus[J].J Bacteriol，2008，190（4）：1401-1412.

[20] TIMME RE，PETTENGILL JB，ALLAR MW，et al.Phylogenetic divers-ity of the enteric pathogen salmonella enterica subsp.enterica inferred from genome-wide reference-free SNP characters[J].Genome Biology & Evolution，2013，5（11）：2109-2123.endprint