菜薹（菜心）—芥蓝杂交亲和性分析及后代性状表现

魏云晓 李 菲 张淑江 章时蕃 张 慧 孙日飞

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点试验室，北京 100081）

菜薹（菜心）—芥蓝杂交亲和性分析及后代性状表现

魏云晓 李 菲 张淑江 章时蕃 张 慧 孙日飞*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点试验室，北京 100081）

种间杂交是拓宽遗传种质资源，创造新物种、新材料的重要手段；杂交亲和性及适宜的授粉方法是成功配制杂交组合的重要因素。本试验采用4种授粉方式对菜薹（菜心）和芥蓝进行种间杂交，利用苯胺蓝染色法观察花粉管生长状况，通过胚挽救幼苗获得率分析种间杂交亲和性，筛选杂交亲本，并对后代进行倍性鉴定、形态学及细胞学分析。结果表明：蕾期授粉4次有助于获得杂种幼苗，菜心材料755适宜作杂交母本；花粉管生长状况与胚挽救幼苗获得率之间的相关性达极显著水平，利用苯胺蓝染色法可以辅助预测种间杂交亲和性。田间调查结果表明，杂种后代株型偏母本，营养生长旺盛，是培育新型菜用甘蓝型油菜的中间材料。

菜薹（菜心）；芥蓝；种间杂交；亲和性；荧光显微法

菜薹（菜心）〔Brassica rapa L. ssp. chinensis（L. ） var. utilis Tsen et Lee，AA，2n=20〕是十字花科芸薹属白菜亚种中以花薹为产品的变种，营养丰富。菜心主要由白菜类蔬菜中易抽薹类型材料长期选育而成，导致其遗传资源背景狭窄，且推广品种在抗逆性和品质方面不能满足市场需求（张华和刘自珠，2010；张艳 等，2012；晏儒来，2014）。芥蓝（Brassica oleracea var. alboglabra，CC，2n=18）属于芸薹属甘蓝种，以花薹为产品，风味独特。芥蓝栽培品种主要为地方常规品种，因此存在产量低、品质差等问题（秦耀国 等，2009；吴文林 等，2012；晏儒来，2014）。

远缘杂交可以综合亲本优势或创造新的杂种优势，促进基因间交流和新物种的形成；利用种间杂交可以丰富物种的遗传背景，培育含有理想农艺性状的栽培类型，是遗传改良的重要途径（林超 等，2007）。梁红等（1994）采用菜心与甘蓝进行正反交，杂交后代的一般性状介于两亲本之间，并表现出强烈的生长优势，蛋白质含量、游离氨基酸含量等超亲，杂交优势显著。Snowdon等（2000）通过白芥与甘蓝型油菜远缘杂交，将抗黑胫病基因从白芥转移到甘蓝型油菜上。于海龙等（2015）通过芥蓝与甘蓝型油菜杂交，创制了Ogura细胞质不育材料。前人通过远缘杂交获得杂种后代，转育有利基因，创造新的作物类型（梁红 等，1994；满红，2007；Sheng et al.，2008；孔芳，2010；乔海云 等，2012；阴涛 等，2014）。但是鲜有关于多个品种菜心与芥蓝杂交的研究报道。

本试验采用二倍体菜心与二倍体芥蓝杂交，通过苯胺蓝染色法与胚挽救幼苗获得率对种间杂交亲和性进行分析，筛选亲和性较高的材料，为种间杂交组合配制提供理论基础；杂种后代的获得丰富了育种资源，可以为菜心育种、芥蓝育种及菜用甘蓝型油菜的选育提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试3份菜心材料的编号为755、756、758，3份芥蓝材料的编号为719、722、723。其中，755、756为中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜课题组多年选育材料；其余均为品种，亦由本所白菜课题组提供（表1）。

表1 参试材料来源及其主要特征特性

1.2 试验方法

1.2.1 种间杂交 各试验材料均于2015年1月21日播种，3月6日定植于本所实验基地塑料大棚内，植株现蕾后7 d开始授粉。以菜心为母本、以 芥 蓝 为 父 本， 配 制 755×719、755×722、755×723、756×719、756×722、756×723、758×719、758×722、755×723等9个杂交组合，每个组合采用4种授粉方式授粉，共36个处理。① 蕾期授粉1次：晴夭上午，选择还有2～3 d开花的健壮花蕾，去雄后授以芥蓝花粉；② 蕾期授粉4次：上午、下午各授粉1次，连续授粉2 d；③ 延迟授粉1次：晴夭上午，选择还有2～3 d开花的健壮花蕾，去雄后48 h授以芥蓝花粉；④ 延迟授粉4次：上午、下午各授粉1次，连续授粉2 d。

1.2.2 苯胺蓝染色法观察花粉管 分别取各处理授粉后24 h的雌蕊20个。固定：立即浸泡在FAA固定液中（无水乙醇∶乙酸=3V∶1V）24 h，雌蕊绿色褪去变为白色；软化：依次放入70%、50%、30%酒精中洗涤10 min，然后浸泡到16 mol·L-1NaOH溶液中，室温处理12 h，雌蕊接近透明状态；染色：放入0.108 mol·L-1K3PO4溶液中洗涤10 min，然后浸泡到0.1%苯胺蓝染色液（用0.108 mol·L-1K3PO4配置，pH≈11）中，黑暗处理12 h；观察：将雌蕊放到载玻片上，滴加甘油调节花粉管的分散程度，先用立体显微镜观察雌蕊柱头有无荧光并计数，盖上盖玻片后观察花粉管生长状况（Mori et al.，2006；Chae et al.，2009）。利用 SPSS 软件进行差异显著性分析。

1.2.3 胚挽救 分别取各处理授粉后10～12 d的子房，首先用75%的乙醇消毒1 min，然后用8%的次氯酸钠灭菌15 min，最后用无菌水冲洗3次。用镊子剥取子房中的胚珠，接种到B5培养基上。接种胚珠在温度（25±2）℃、光照10 h·d-1、光照强度2 000 lx条件下培养30～50 d。成活胚珠的幼苗经分化和生根后定植于玻璃温室，常规管理（乔海云，2012）。计算胚挽救幼苗获得率，利用SPSS软件进行差异显著性分析。

1.2.4 种间杂种鉴定 形态学鉴定：观察、记录F1植株营养生长与生殖生长阶段的形态学变化。

倍性鉴定：2016年8月2日，采用流式细胞仪进行倍性分析。取F1植株及亲本新鲜幼嫩叶片30～40 mg，加入2 mL预冷的Galbraith缓冲液〔45 mmol·L-1MgCl2，30 mmol·L-1柠檬酸钠，20 mmol·L-1MOPS，0.1% TritonX（m/V），pH=7〕，用锋利的刀片快速切碎，经30 μm孔径的尼龙膜过滤至2.5 mL离心管中，2 000 rpm离心3 min，倒掉上清液，向离心管中加入500 μL PI染液。振荡混匀，15 min后取细胞悬浮液用流式细胞仪进行分析（饶琳莉，2015）。

花粉育性检测：2016年8月8日上午9：00～10：00，取F1完全开放的新鲜花朵，在载玻片上滴1滴1%的醋酸洋红染液，使花粉粒游离在染色液中，染色5 min后盖上盖玻片镜检。每朵花选取500个花粉粒作为观察对象，统计花粉染色成功率（Li et al.，2015）。

2 结果与分析

2.1 利用苯胺蓝染色法观察花粉管生长状况

由图1及表2、3、4可知，菜心材料755、756、758的柱头花粉萌发能力有显著差异，柱头有荧光的雌蕊平均数分别为13.50、11.67、11.42个，可观察到花粉管的雌蕊平均数分别为3.12、2.42、1.25个，表明菜心材料755杂交亲和性较高。以芥蓝材料719、722、723为父本，杂交母本柱头有荧光的雌蕊平均数分别为12.75、11.80、12.00个，可观察到花粉管的雌蕊平均数分别为3.00、2.25、1.75个，表明芥蓝材料719适宜做杂交父本。蕾期授粉1次、蕾期授粉4次、延迟授粉1次、延迟授粉4次处理柱头有荧光的雌蕊平均数分别为12.00、13.67、11.33、11.78个，可观察到花粉管的雌蕊平均数分别为3.56、2.44、2.00、1.44个，表明蕾期授粉效果比延迟授粉好，授粉次数之间的差异不明显。

差异显著性分析结果表明（表3、4），蕾期授粉4次与其他授粉方式间柱头有荧光雌蕊数、可观察到花粉管雌蕊数差异均达显著水平，其他3种授粉方式之间差异不显著。菜心材料755与756、758之间柱头有荧光雌蕊数、可观察到花粉管雌蕊数差异均达显著水平，而芥蓝材料719、722、723之间无显著差异。表明蕾期授粉4次及母本材料差异对杂交亲和性有显著影响。

图1 苯胺蓝染色后花粉管生长状况

表2 不同授粉方式对菜心和芥蓝杂交亲和性的影响

2.2 不同处理胚挽救幼苗获得率

由表2可知，本试验共获得胚挽救的幼胚总数为1 238个，成功获得幼苗234株。菜心材料755、756、758胚挽救幼苗获得率不一致，平均值分别为29%、18%、6%，与苯胺蓝染色法的观察结果一致，表明菜心材料755适宜做杂交母本。以芥蓝材料719、722、723为父本，胚挽救幼苗获得率的平均值分别为24%、18%、22%，表明芥蓝材料719适宜做杂交父本。蕾期授粉1次、蕾期授粉4次、延迟授粉1次、延迟授粉4次处理的胚挽救幼苗获得率平均值分别为12%、31%、11%、18%，表明蕾期授粉效果比延迟授粉好，授粉4次的效果比授粉1次的效果好。

差异显著性分析结果表明（表3、4），蕾期授粉4次与其他授粉方式间的胚挽救幼苗获得率有显著差异，其他3种授粉方式之间无显著差异。菜心材料755与758之间的胚挽救获得率有显著差异，而芥蓝材料719、722、723之间差异不显著。表明蕾期授粉4次及母本材料差异对杂交亲和性有显著影响。

表3 4种授粉方式的差异显著性分析

表4 不同亲本的差异显著性分析

利用SPSS统计分析软件进行胚挽救幼苗获得率与柱头有荧光雌蕊数和可观察到花粉管雌蕊数的相关性分析。三者之间呈极显著正相关（P＜0.01），胚挽救幼苗获得率与可观察到花粉管雌蕊数之间的相关系数R2=0.814，表明胚挽救概率及荧光显微法预测杂交亲和性可得到一致的结论。

2.3 杂种后代表现

2.3.1 形态学表现 F1植株（异源单倍体）各性状介于亲本之间，茎秆有微量蜡粉，下部叶片裂叶明显，侧枝较主枝叶片颜色深、茎秆蜡粉少，与亲本芥蓝一样开白花（图2）。母本相同、父本不同杂交所得F1植株形态相似，抽薹高度相似；父本相同、母本不同杂交所得F1植株形态差异较大，以755作母本的F1叶片较小，主薹高于叶片，株型与755相似；以756、758作母本的F1则叶片较大，主薹与叶片高度齐平，株型与母本相似，表明杂种后代植株形态有明显的母本偏向性；且杂种后代分枝多，生长势均比亲本强，与王国槐等（2003）、崔彬彬和李云（2006）、赵琴（2015）的研究结果一致。

2.3.2 倍性鉴定 由图3可见，亲本菜心的荧光强度高峰位于190，芥蓝的荧光强度高峰位于245；异源单倍体的荧光强度高峰位于220，为亲本的平均值；异源二倍体荧光强度高峰位于435，为单倍体的二倍。经验证，234个杂种后代中有3株自然加倍为异源二倍体，其他杂种均为异源单倍体。

2.3.3 育性检测 花粉育性检测结果显示，异源单倍体花粉呈现两种情况，一种是杂种花粉表现为完全不育，可染率为0；一种是杂种花粉表现为少量花粉，可染率为41.21%。异源二倍体的花粉活性较好，花粉可染率为96.00%（图4）。

图2 菜心和芥蓝杂交F1植株（异源单倍体）形态特征

图3 菜心、芥蓝及典型后代流式细胞图

图4 菜心和芥蓝杂交F1的成熟花粉粒

3 结论与讨论

前人采用胚挽救幼苗获得率分析物种之间的亲和性（乔海云 等，2012；何丽 等，2013；文雁成等，2014）；利用苯胺蓝染色法观察花粉管生长状况来预测杂交亲和性（马丰山 等，1986；王爱云 等，2006； 张 潇 等，2015；Katarzyna et al.，2015）。本试验同时采用这两种方法分析菜心和芥蓝种间杂交亲和性，结果表明胚挽救幼苗获得率与可观察到花粉管的概率和柱头荧光概率相关性极显著。花粉在柱头上萌发，柱头显示荧光，由于柱头乳突细胞和花粉识别过程中产生化学物质引发亲和性障碍，花粉管形成胼胝质塞或者乳突细胞胼胝质反应阻碍，所以只有少数萌发的花粉穿过乳突细胞，完成受精。说明可观察到花粉管的概率和柱头荧光概率可以准确预测杂交亲和性。本试验中不同组合杂交亲和性存在差异，差异显著性分析结果表明乳突细胞和花粉识别与杂交材料密切相关。菜心材料755与芥蓝杂交亲和性高，适宜作杂交亲本；而758柱头花粉不易萌发，表明不亲和，不适宜用作杂交亲本。

吴俊等（1999）认为不亲和反应抑制因素在刚开花前出现，所以蕾期授粉可以提高受精率。王静（2008）提出延迟授粉会增加远缘杂交的受精率。此外，用异源花粉多次授粉可消耗柱头上的识别蛋白（林超 等，2007）。本试验采用4种授粉方式所得结果与前人结论一致：多次授粉效果比1次授粉好；蕾期授粉效果比延迟授粉好。预测存在某一时刻抑制因素最少，异源花粉最易进入与胚珠结合，可以进一步设置更多的授粉时间段来确定最佳授粉时间。差异显著性分析表明蕾期重复授粉效果最好，与其他授粉方式间差异达显著水平。

卢长明（1998）以白花芥蓝与黄花白菜杂交，后代开白花，说明在人工甘蓝型油菜基因组中白花基因对黄花为显性或具上位性。本试验以黄花菜心与白花芥蓝杂交，获得的杂交后代均开白花，与前人的研究结果一致。本试验所得异源单倍体及异源二倍体基部叶片均表现裂叶明显，裂叶性状在亲本中都无表现，推测是由于杂种后代两套基因组AA和CC相互作用存在差异的结果（刘爱华 等，2003；饶琳莉，2015；Li et al.，2015）。此外，调查发现同一杂交组合后代花粉的可染率不一致，大部分表现为完全不育，少部分表现为少量花粉，与小麦远缘杂交中的现象类似，单倍体AC中可能也存在未减数配子基因，形成具有活力的配子（罗江陶，2015）。胚挽救获得3株自然加倍异源二倍体，通过回交、自交等手段可应用于异附加系等细胞学研究。杂种后代田间表现生长旺盛，分枝能力强，可进一步研究F1、F2等后代及亲本蛋白质、碳水化合物、硫苷等物质变化，分析后代作为培育菜用甘蓝型油菜材料的应用价值。

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Analysis on Interspecif i c Hybridization Compatibility and Progeny Characteristics of Flowering Chinese Cabbage and Chinese Kale

WEI Yun-xiao，LI Fei，ZHANG Shu-jiang，ZHANG Shi-fan，ZHANG Hui，S UN Ri-fei*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）

The interspecific hybridization is an important method for creating new species and enriching genetic germplasm resource．The hybridization compatibility and suitable pollination method are critical factors for successfully preparing hybrid combinations．This experiment adopted 4 pollination methods to conduct interspeicific crossing between flowering Chinese cabbage〔Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）var. utilis Tsen et Lee〕and Chinese kale（Brassica oleracea var. alboglabra），observed the situation of pollen tube growth with anilin blue staining method，analyzed the interspecific hybridization affinity by rate of embryo rescue，selected hybrid parents，and conducted ploidy identification，orphological and cytological analysis on the progeny．The results showed that multiple pollination in bud stage was helpful to obtain hybrid seedlings and material 755 is suitable for being female parent in hybridization．Besides，the status of pollen tube growth and hybrid rate by embryo rescue had extreme significant correlation，and anilin blue staining method could assist forecasting the hybridization compatibility．Moreover，the results of field investigation indicated that the plant type of hybrid progeny was partial as female parent with vigorous growth．This hybrid progeny was good intermediate material for breeding vegetable Brassica napus L. of new type．

Chinese cabbage；Chinese kale；Interspecific hybridization；Compatibility ；Fluorescence microscopy

魏云晓，女，博士研究生，专业方向：白菜遗传育种，E-mail：yuluoyunxiao@126.com

*

（Corresponding author）：孙日飞，男，研究员，博士生导师，专业方向：白菜遗传育种，E-mail：sunrifei@caas.cn

2017-07-13；接受日期：2017-09-11

国家重点研发计划项目（2016YFD0101701）