三维重建观察四氯二苯并二恶英对胎鼠腭器官发育的影响

柴继侠 申德祥 梁晓婉 周青 张志诚 康建华 褚忆忆 柴强

三维重建观察四氯二苯并二恶英对胎鼠腭器官发育的影响

柴继侠 申德祥 梁晓婉 周青 张志诚 康建华 褚忆忆 柴强

目的三维重建观察四氯二苯并二恶英(tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)对胎鼠腭器官发育的影响。方法对妊娠12.5 d昆明鼠进行40 μg/kg TCDD灌胃处理作为实验组，等剂量的玉米油处理作为对照组。妊娠13.5、14.5、 15.5 d 时，取出胎鼠头部固定，制备腭器官石蜡连续切片， 苏木精-伊红染色，采集腭器官的图像用Photoshop处理、3D-DOCTOR软件对腭器官进行三维重建。结果3D-DOCTOR三维重建显示，对照组腭器官从舌两侧移至舌上方，逐渐靠拢并融合；实验组腭器官从舌两侧延迟于对照组移至舌上方渐靠拢，但并未融合，形成腭裂。结论3D-DOCTOR重建可观察腭器官发育过程和TCDD作用于孕鼠导致胎鼠腭裂形成过程。

四氯二苯并二恶英(TCDD)； 腭器官； 三维重建； 侧腭突； 发育

四氯二苯并二恶英(tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是一类持久性环境有机污染物，对人类健康和环境安全构成极大威胁，可来源于汽车尾气、垃圾焚烧、农药等[1]。研究表明，TCDD可致多种人类发育缺陷发生，其中包括腭裂畸形[2]。小鼠的腭器官发育与腭裂形成与人类相似，通过解剖镜、光镜和电镜等研究方法表明 TCDD与腭裂畸形发生密切相关[3-6]。

宏观生物组织的三维重建通过高分辨率CT和磁共振仪器等在临床工作中已广泛使用，但对生物组织显微结构的组织重建仍未普及[7]。由于显微镜下的一个视野中只能显示标本的局部。即便如此，利用连续的组织切片仍然可以进行组织器官的三维重建[7-9]。

本文通过Photoshop和3D-DOCTOR软件三维重建观察TCDD对胎鼠腭器官发育的影响，为腭器官的发育和腭裂形成提供可视化模型，为建立腭器官发育和腭裂形成的数字化模型打下基础。

1 材料与方法

1.1 标本与分组

成年昆明系小鼠15 只雌鼠， 5 只雄鼠，适应性饲养2 周后小鼠合笼，雌雄比例为3∶1，自由进食和饮水。每12 h观察合笼的雌鼠，如发现阴栓者记为妊娠0.5 d，称重后单独饲养。 12 d后小鼠体重若增加2 g以上，且腹部可以看到明显隆起，则认为妊娠。将妊娠鼠随机分为实验组和对照组。在妊娠12.5 d时，实验组小鼠一次性给予40 μg/kg TCDD灌胃处理，对照组给予等剂量的玉米油。在妊娠13.5、 14.5、 15.5 d时，取出胎鼠(分别记为ED13.5、 ED14.5、ED15.5)，留取胎鼠头部于4%多聚甲醛溶液中固定，48 h后脱水和石蜡包埋。

1.2 连续切片HE染色

将各组蜡块进行连续切片，厚度为7 μm。将含有腭器官侧腭突的蜡片依次贴附在APES防脱处理的载玻片上。按照蜡片的序号如1、3号蜡片贴在A-1号载玻片上，2、4号蜡片贴在B-1号载玻片上，1 个标本制成2 套相近的玻片。将腭器官的连续切片进行HE染色。先染A套片，如果A套片里染色不好或者碎裂的话，取B套对应的片号重新染色。

1.3 图像采集和拼接

将每组HE染色的玻片按照顺序，在本校显微形态综合实验室中的MOTIC数码互动实验室的教师机上拍摄图像，放大40 倍，一张图片拍不下全部组织结构的话，就分上下2 次拍摄，并依次进行命名，保存格式为JPEG。利用Photoshop软件，将同一个标本的2 张图像拷贝到画布中，参照刘宏建等[7]的方法进行图像的拼接，拼接完成后保存图片。

1.4 图像配准

由于组织切片在贴片时，不可能保证前后贴片的位置完全一致，因此必须进行图像配准。打开Photoshop软件，建立高2 000 bp宽2 000 bp大小的画布，将图像以小鼠鼻中隔中线为垂直线旋转；确定某组织固定点在坐标固定位置上，将连续切片的图像，采用内定位法[7]即图层配准法[9]，进行图像配准；将配准后的图片以JPEG和PSD格式保存。

1.5 三维重建

使用3D-DOCTOR软件对配准后的图像进行三维重建。打开3D-DOCTOR软件，点击创建New Stack，添加文件，选取配准后图像的文件夹，选中一个标本所有的配准后的图像文件，打开后则添加至操作界面。选择Object Management，给所需勾选的组织结构命名以及选取相应的颜色。点击Boundary Editor进行组织结构的边界勾选，完成所有图像选定结构的边界勾选。选择工具栏中的3D合成中表面合成选项，即可获得三维重建的可视化模型。

2 结 果

小鼠腭器官发育和TCDD对腭器官发育影响的HE图像见图 1，其三维重建图像见图 2～3。 HE图像和三维重建图像均显示：对照组小鼠腭器官的侧腭突在ED13.5时，位于舌的两侧；ED14.5时两侧的侧腭突上抬到舌的上方，对向生长，渐接触；ED15.5时两侧的侧腭突接触融合。TCDD实验组的侧腭突在ED13.5时位于舌的两侧；ED14.5时仍位于舌两侧，但体积增大；ED15.5时两侧的侧腭突上抬到舌的上方，体积较大，但没有接触融合。

3 讨 论

3.1 腭器官发育和TCDD对腭器官发育的影响

腭器官的形成和发育是一个连续而复杂的生物学过程。腭器官由前腭突和侧腭突2部分组成。本文研究的主要是胚胎时期腭器官中侧腭突的发育过程，HE染色和三维重建均显示，侧腭突的发育过程和尹海燕等[10]研究结果相似：胚胎早期，舌几乎完全充满原始口鼻腔，所以侧腭突沿着舌的两侧向下垂直生长。随着胚胎继续发育，舌的形态逐渐变得扁平，位置开始下降，同时，2 个侧腭突上抬，位于舌的上方并水平生长。最终两侧腭突相互接触融合，继续发育至成熟。

唇腭裂作为严重的出生缺陷，是常见的先天性畸形之一，患病率为0.1%[11]，为儿童头面部的首发先天性畸形，是环境和遗传因素相互作用所致的多基因遗传病，其病因仍未完全明确[6]。环境污染物TCDD在众多致畸因素中，与腭裂发生之间的关系越来越受到关注[3-6，12]，主要从不同动物、不同剂量、不同作用时间的腭器官发育的解剖镜、光镜和电镜等来研究。本文则主要根据小鼠腭器官HE的光镜图像进行腭器官发育的三维重建研究，结果显示TCDD可影响腭器官发育，主要是通过影响侧腭突的生长和上抬，导致侧腭突体积较小、上抬延迟，最终两侧腭突不能在中线接触融合，成功地建立了TCDD对腭器官发育影响的三维可视化模型。

3.2 三维重建及遇到的问题

图 1 2 组腭器官发育过程的HE图片 (×4)

Fig 1 HE stain pictures of palatal organ development process in 2 groups (×4)

在该研究实验进程中，遇到的一些问题和需要完善的地方总结如下：①判断妊娠：观察合笼雌鼠的阴栓时，应当严格按照12 h的间隔，否则阴栓会溶解造成漏检；对于不明显的小阴栓或者阴道内有明显的液状分泌物时，可列为疑似妊娠；在列为妊娠或疑似妊娠的同时要给小鼠称重，12 d后再次称重，此时体重至少要超过2 g，并且同时观察小鼠的腹部要明显隆起。②外定位的尝试：曾尝试用头发、细棉线、小鼠肌肉等，但效果均不佳。头发进行外定位，包埋时头发很容易漂移，3 根头发很难同时平行于小鼠头部外侧，贴片和染色时，头发也很容易丢失。细棉线进行外定位，连续切片时，细棉线不易被切断，且易刮伤组织。小鼠的腓肠肌定位，贴片和染色时易脱落。由于时间和操作技能的原因，本实验只采用了内定位方法。③完整的连续切片：三维重建对组织切片的连续性、完整性要求较高。连续切片时，容易出现组织碎裂、重叠、标本偏斜等，分析原因，调整脱水时间，提高实验技能等，尽可能切出完整的连续切片。连续切片光镜图像的数量与质量直接影响三维重建效果。④软件的处理：在Photoshop和3D-DOCTOR软件处理时，尤其是图像配准和组织的边界勾画时，一定要仔细、认真、准确，尽可能地减少误差。此外熟练掌握和灵活应用这两种软件也可以提高三维重建的效果。

要想有更准确更完美的腭器官发育和TCDD对腭器官发育影响的三维重建的可视化模型和准确的数字化模型还需继续提高各项技能，重建出小鼠准确的腭器官发育和TCDD对腭器官发育影响的数字化模型，为腭器官的发育和腭裂形成的机制研究提供更准确、更直观的参考数据。

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3-Dreconstructionoftetrachlorodibenzo-p-dioxineffectedpalatalorgandevelopmentmodeloffetalmouse

CHAIJixia1,SHENDexiang2,LIANGXiaowan2,ZHOUQing2,ZHANGZhicheng2,KANGJianhua2,CHUYiyi2,CHAIQiang3.

1. 233030,DepartmentofHistologyandEmbryology,BengbuMedicalCollege,China; 2.DepartmentofPsychologicMedicine,BengbuMedicalCollege; 3.DepartmentofStomatology,TheFourthAffiliatedHospitalofZhejiangUniversityMedicalCollege,Yiwu,

Objective: To study the feasibility of 3-D reconstruction model in the observation of tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD) effected palatal organ development of fetal mouse.MethodsKunming mice treated 40 ug/kg TCDD by lavage on day 12.5 of pregnancy were used as in the experimental group, isodose corn oil treated in the control group. On day 13.5, 14.5 and 15.5 of pregnancy heads of the fetal mice were taken out and fixed. Conventional paraffin serial sections of palatal organ were preparated and dyed by hematoxylin-eosin, images of the palatal organs were collected and photoshop treated, 3-D reconstruction of the palatal organ was performed by 3D-DOCTOR software.Results3-D reconstruction images showed that palatal organs moved from on both sides above the tongue and gradually closed and merged in the control group. In the experimental group, the palatal organs moved from on both sides above the tongue was later than control group, gradually closed, but not merged, formed cleft palate.Conclusion3D-DOCTOR software reconstruction can be used for the study of the development process effected by TCDD in the pregnant mouse.

Tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD);Thepalatalorgan;Three-dimensionalreconstruction;Lateralpalatalprocess;Development

安徽省大学生创新项目(编号：AH201410367025)； 安徽高校省级自然科学研究重点项目(编号： KJ2014A166)

233030， 蚌埠医学院组胚教研室(柴继侠)， 蚌埠医学院精神医学系(申德祥 梁晓婉 周青 张志诚 康建华 褚忆忆)； 浙江大学第四附属医院口腔科(柴强)

柴继侠 E-mail： chaichai123456@163.com

Q954.48, R321.5

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.006

(收稿： 2016-11-18 修回： 2017-02-14)