老年Wistar大鼠脂联素与脂蛋白脂肪酶的相关性

陈灶萍， 刘 军， 查兵兵， 丁和远， 吴跃跃

复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌科,上海 200240

·论著·

老年Wistar大鼠脂联素与脂蛋白脂肪酶的相关性

陈灶萍， 刘 军*， 查兵兵， 丁和远， 吴跃跃

复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌科,上海 200240

目的探讨老年Wistar大鼠脂联素与血脂代谢紊乱及脂蛋白脂肪酶(LPL)的相关性。方法根据月龄，将Wistar大鼠分为老年组(20个月龄)、中年组(7个月龄)和青年组(3个月龄)。分别测定各组大鼠血清空腹血糖(FBG)、血脂和脂联素。应用real-time PCR检测大鼠皮下脂肪组织脂联素mRNA、LPL mRNA及肝脏LPL mRNA的表达水平。结果随着月龄增加，血清脂联素及脂肪脂联素mRNA、LPL mRNA及肝脏LPL mRNA表达水平逐渐下降；老年组上述指标显著低于青年组(P<0.01)。老年组总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、FBG水平高于青年组，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于青年组(P<0.05)。Pearson相关分析显示，血清脂联素与脂肪LPL mRNA、肝脏LPL mRNA和HDL-C正相关(P<0.05)，与体质量、月龄、TC、LDL-C、VLDL-C和TG负相关(P<0.05)；脂肪脂联素mRNA与脂肪LPL mRNA、肝脏LPL mRNA、血清脂联素、HDL-C正相关(P<0.05)，与体质量、月龄、TC、LDL-C、VLDL-C负相关(P<0.05)；脂肪LPL mRNA与脂肪脂联素mRNA、肝脏LPL mRNA、血清脂联素、HDL-C正相关(P<0.05)，与体质量、月龄、TC、LDL-C、VLDL-C、TG负相关(P<0.05)。多元逐步回归分析显示，血清脂联素与VLDL-C呈独立负相关(P<0.05)；脂肪脂联素mRNA与TC、月龄独立负相关(P<0.05)；脂肪LPL mRNA与月龄独立负相关(P<0.05)。结论老年大鼠皮下脂肪和血清脂联素水平降低；脂联素水平下降与老年大鼠脂代谢紊乱有关，其可能通过调节LPL表达来影响血脂代谢。

老年；脂联素；血脂代谢；脂蛋白脂肪酶

近年来，老年人血脂代谢异常的患病率明显升高，但机制尚不明确[1]。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)是调节脂质代谢和转运过程的关键酶。研究[2]发现，LPL和脂联素在严重的代谢综合征患者中均减少，且脂联素与LPL活性正相关。我们的既往研究[3]发现，随着年龄增加，脂联素水平逐渐降低，推测老年人脂质紊乱可能与低脂联素水平导致LPL活性下降有关。因此，本研究拟在大鼠模型中通过分析年龄增加、脂联素、LPL变化的关系，探讨脂代谢紊乱的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及标本留取 健康雄性Wistar大鼠36只(中国科学院上海生命科学研究院实验动物中心提供)按月龄分为3组(n=12)：老年组(20个月龄)，中年组(7个月龄)，青年组(3个月龄)。大鼠自由进食、水，环境温度为(25±1)℃，昼夜周期为12 h/12 h，适应性喂养1周后，所有动物均空腹处死，处死前称体质量，经腹主动脉采血，取5 mm×5 mm×5 mm大小肝脏组织及皮下脂肪组织各2块。血标本离心后留取血清，肝脏及脂肪组织置于1.5 mL的EP管中，液氮冷却后转-70℃低温冰箱保存，用于RNA提取。

1.2 血清脂联素及血脂谱、血糖测定 血清脂联素与极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)采用ELISA法(试剂盒购自美国B-Bridge公司)。总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用酶法。空腹血糖(FBG)采用己糖激酶法(浙江奥的特生物技术有限公司)。血清血糖、血脂采用罗氏全自动生化分析仪检测。

1.3 脂肪组织脂联素mRNA、LPL mRNA和肝脏LPL mRNA测定 分别采用TRIzol试剂抽提组织RNA 1 μg，反转录为cDNA，再进行荧光定量PCR扩增。采用Primer 5.0软件设计引物序列。脂联素引物，上游：5′-GTT CCT CTT AAT CCT GCC CAG TC-3′，下游：5′-GTC ACC CTT AGG ACC AAG AAC AC-3′；产物长214 bp。LPL引物，上游：5′-GCA CAG TGG CTG AAA GTG AGA AC-3′，下游：5′-GAC CAG CGG AAG TAG GAG TCG TT-3′；产物长151 bp。每一标本取cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，ddH2O 8.2 μL，最后反应总体积为20 μL。用封口膜(荧光定量专用)覆盖96孔PCR板瞬间离心后放入荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。反应条件：先在95℃预变性5 min，然后95℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共40个循环。将预试验的PCR产物以10倍浓度梯度稀释，以稀释产物作为标准品模板，进行荧光定量PCR反应生成反应数据，应用软件Rotor-Gene 6.0生成标准曲线。通过此标准曲线来计算Ct值，经内参照GAPDH校正，校正值用2-ΔΔCt进行统计分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量及血清检测结果比较 结果(表1)显示：随着月龄增加，血清脂联素水平逐渐下降，老年组显著低于青年组(P<0.01)。老年组TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平最高，中年组次之，青年组最低。其中，老年组TC、TG、LDL-C水平显著高于青年组(P<0.05)，而中年组较青年组差异无统计学意义。三组间两两比较VLDL-C水平及体质量差异有统计学意义(P<0.05)。老年组及中年组FBG水平高于青年组(P<0.05)。老年组HDL-C水平低于青年组(P<0.05)。

表1 各组大鼠体质量及血清检测结果的比较 n=12,

*P<0.05,**P<0.01与青年组相比；△P<0.05与中年组相比

2.2 总RNA提取及RT-PCR结果的鉴定 结果显示：总RNA琼脂糖凝胶电泳结果可见5 S、18 S、28 S 3个条带，说明所提取的RNA的完整性较好。RT-PCR产物电泳显示目的基因片段与预期设计的目的基因片段大小相符，提示成功扩增了目的基因。2.3 各组大鼠脂肪组织脂联素mRNA、LPL mRNA及肝脏LPL mRNA表达水平比较 结果(表2)显示：青年组脂肪脂联素mRNA、脂肪LPL mRNA表达水平最高，中年组次之，老年组最低(P<0.05)。老年组、中年组肝脏LPL mRNA表达水平高于青年组(P<0.05)。

表2 各组间脂肪脂联素 mRNA、LPL mRNA及肝脏LPL mRNA表达水平的比较 n=12,

*P<0.05,**P<0.01与青年组相比；△P<0.05 与中年组相比

2.4 Pearson相关分析 结果(表3)显示：血清脂联素水平与HDL-C正相关，与体质量、月龄、TC、LDL-C、VLDL-C、TG负相关。

脂肪脂联素mRNA表达水平与脂肪LPL mRNA、肝脏LPL mRNA、血清脂联素、HDL-C水平正相关，与体质量、月龄、TC、LDL-C和VLDL-C负相关。

脂肪LPL mRNA表达水平与脂肪脂联素mRNA、肝脏LPL mRNA表达水平、血清脂联素和HDL-C正相关，与体质量、月龄、TC、LDL-C、VLDL-C、TG水平负相关。

2.5 Logistic多因素回归分析 分别以血清脂联素水平、脂肪脂联素mRNA表达、脂肪LPL mRNA表达为因变量，月龄、体质量、血脂为自变量进行多元逐步回归分析。结果显示：血清脂联素水平与VLDL-C独立负相关(P=0.000)；脂肪脂联素mRNA表达水平与TC(P=0.040)、月龄(P=0.000)独立负相关；脂肪LPL mRNA表达水平与月龄独立负相关(P=0.000)。

表3 血清脂联素、脂肪脂联素mRNA、脂肪LDL mRNA与相关代谢指标的Pearson相关分析

3 讨 论

人类血脂水平与年龄密切相关，老年人血脂异常患病率明显增加，以总TC、TG增高及高密度脂蛋白(HDL)降低为主[4]。Wistar大鼠的平均寿命为2.5～3年, 20个月龄Wistar大鼠已经进入老年，相当于人类70岁。本研究发现，在大鼠自然衰老的进程中，TC、TG、LDL-C、VLDL-C、FBG均逐渐升高，HDL-C逐渐降低，与人类基本相符。该结果可能与脂联素水平下降有关。本研究证实，随着月龄增加，大鼠血清脂联素浓度降低。该结果与我们之前对糖尿病患者一级非糖尿病亲属的5年随访中观察得出的结论一致[3]。

脂联素与糖脂代谢的调控关系密切[5]。低脂联素血症常伴有HDL-C降低和TG水平升高[6-7]，肥胖患者、2型糖尿病患者的脂联素水平降低[2，8-9]。血清脂联素水平的下降主要与脂肪脂联素mRNA表达下降有关[10]。本研究证实，随着月龄增加，大鼠脂肪脂联素mRNA表达降低，脂联素mRNA表达水平与HDL-C正相关，与体质量、月龄、TC、LDL-C和VLDL-C负相关，进一步Logistic分析显示，增龄是导致脂联素水平降低的独立因素。以上结论可以推测老年大鼠脂质紊乱与低脂联素水平相关。

血清LPL与TG负相关，与HDL-C正相关[11]，但血清LPL稳定性欠佳。本研究采用Real-time PCR测定大鼠皮下脂肪组织和肝脏LPL mRNA的表达水平，显示皮下脂肪组织LPL mRNA表达水平与TG、TC、LDL-C、VLDL-C负相关，与HDL-C正相关，说明皮下脂肪组织LPL mRNA表达水平与血脂代谢关系密切，可较好地反映体内LPL的代谢状态。本研究结果显示，皮下脂肪组织LPL mRNA表达水平与体质量、月龄负相关，在校正其他影响因素后仍与月龄独立负相关，提示增龄是导致脂肪LPL mRNA表达下降的重要原因。

LPL主要在脂肪组织和肌肉中表达，而脂肪组织是脂联素的唯一来源。因此，在脂联素和LPL之间可能存在一种直接或间接的联系。Terazawa-Watanabe等[12]研究发现，肥胖、代谢综合征及2型糖尿病女性LPL均与脂联素相关，LPL的降低可能与低脂联素血脂有关，并导致血脂紊乱。LPL与脂联素水平在严重的代谢综合征中均减少[2]，在急性心肌梗死患者中也降低。两者相互影响，脂联素水平和LPL活性独立正相关[13]。本研究也显示，大鼠皮下脂肪组织脂联素mRNA表达与LPL mRNA表达水平正相关，且两者均随增龄而降低。因此，本研究提示老年大鼠脂质代谢紊乱的可能机制是脂联素水平下降，下降的脂联素导致LPL mRNA表达下调，从而使LPL的活性下降，最终导致HDL-C水平下降及TG、TC水平升高。

然而，本研究仅初步探讨了老年大鼠脂质代谢紊乱的可能机制，下一步仍需在蛋白水平及细胞水平进行更加深入的验证，从而为人类老年相关的脂质代谢紊乱的发病机制提供参考。

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Correlation between adiponectin and lipoprotein lipase in aged Wistar rats

CHEN Zao-ping, LIU Jun*, ZHA Bing-bing, DING He-yuan, WU Yue-yue

Department of Endocrinology, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective： To explore the relationship between adiponectin and dyslipidemia, lipoprotein lipase (LPL) in aged Wistar rats.MethodsWistar rats were divided into the aged group (20 months old), the middle-aged group (7 months old) and the young group (3 months old) according to the age. Serum fasting blood glucose (FBG), blood lipid, and adiponectin were measured in each group. The expression levels of adiponectin mRNA and LPL mRNA in the subcutaneous adipose tissue and LPL mRNA in the liver were detected by real-time PCR.ResultsWith the increase of age, the expression levels of serum adiponectin and fat adiponectin mRNA, LPL mRNA and liver LPL mRNA gradually decreased; the above indexes in the aged group were significantly lower than those in the young group (P<0.05). The levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), very low density lipoprotein cholesterol (VLDL-C), and FBG of the aged group were higher than those of the young group (P<0.05), and the level of high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) of the aged group was lower than that of the young group (P<0.05). Pearson correlation analysis showed that serum adiponectin was positively correlated with fat LPL mRNA, liver LPL mRNA, and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, VLDL-C, and TG (P<0.05). Fat adiponectin mRNA was positively correlated with fat LPL mRNA, liver LPL mRNA, serum adiponectin, and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, and VLDL-C (P<0.05). Fat LPL mRNA was positively correlated with fat adiponectin mRNA, liver LPL mRNA, serum adiponectin and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, VLDL-C, and TG (P<0.05). Multiple stepwise regression analysis showed that there was an independent negative correlation between serum adiponectin and VLDL-C (P<0.05); there was an independent negative correlation between fat adiponectin mRNA, TC and age (P<0.05); there was an independent negative correlation between fat LPL mRNA and age (P<0.05).ConclusionsThe level of adiponectin in subcutaneous fat and serum decreased in aged rats, and the decrease of adiponectin may be related to dyslipidemia in aged rats. It may affect the blood lipid metabolism by regulating the expression of LPL mRNA.

old age；adiponectin；blood lipid metabolism；lipoprotein lipase

2017-03-02接受日期2017-07-27

上海市卫生和计划生育委员会青年科研项目(20114Y110). Supported by Youth Research Project of Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission (20114Y110).

陈灶萍, 硕士, 主治医师. E-mail: czp028@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-24289502, E-mail: liujun89189@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170165

R -332

A

[本文编辑] 姬静芳