前交叉韧带离断联合半月板切除诱发的骨关节炎早期模型相关基因芯片数据的生物信息学分析

蔡江瑜 盛旦丹 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学科（上海 200040）

前交叉韧带离断联合半月板切除诱发的骨关节炎早期模型相关基因芯片数据的生物信息学分析

蔡江瑜 盛旦丹 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学科（上海 200040）

目的：探讨前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）离断联合半月板切除诱发的骨关节炎（osteoarthritis，OA）的基因表达和生物过程的改变，为OA分子机制的进一步研究提供生物信息学依据。方法：从GEO数据库下载Appleton等构建的ACL离断联合半月板切除诱发的OA早期大鼠模型的基因芯片数据集，应用生物信息学方法筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并进行基因本体论（Gene ontology，GO）和日本京都基因和基因组百科全书代谢通路数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。结果：共筛选出170个DEGs，其中包括97个上调基因和73个下调基因。上调基因主要富集在细胞外基质，并与细胞外基质交互通路等信号通路关系密切。而下调基因主要富集在肌肉收缩的生物学功能中，并与PPAR通路等信号通路关系密切。结论：细胞外基质和肌肉收缩的改变对OA的发生发展起着关键作用。细胞外基质受体交互通路和PPAR信号通路与OA密切相关，值得进一步深入研究。

骨关节炎；差异表达基因；生物信息学

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤是临床常见的运动损伤之一。ACL损伤常会引起关节松弛、半月板损伤、股四头肌肌力下降以及膝关节力学的变化，造成关节功能损害，最终导致骨关节炎（osteoarthritis，OA）的发生[1]。Lohmander等[2]指出，至少50%的ACL损伤患者最终会发生膝关节OA。另外，一篇系统综述中强调，ACL损伤合并半月板损伤时OA的发生概率将进一步增加[3]。OA的病理改变包括软骨的进行性减少和破坏，软骨下骨增厚，骨赘形成，不同程度的滑膜炎症反应，韧带和半月板组织退化，以及关节囊肥大，严重影响患者的日常生活和工作[4]。然而，目前关于ACL损伤引起OA发病和进展的分子机制尚不清楚。生物信息学是近年来生命科学领域的新兴学科，可为疾病的分子机制研究提供新的思路和研究前景。本文通过生物信息学相关方法对Appleton等构建的ACL离断联合半月板切除诱发的骨关节炎早期大鼠模型的基因芯片数据集进行重新分析，以探讨ACL离断联合半月板切除诱发OA的基因表达和生物代谢过程的改变，为OA分子机制的进一步研究提供生物信息学依据。

1 材料与方法

1.1 芯片数据

基因芯片数据集GSE8077来源于NCBI的GEO（Gene Expression Omnibus）数据库，基于GPL1355 平台（[Rat230_2]Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array）。根据其研究方案可知，实验对象为5只大鼠，通过右膝（实验侧）前交叉韧带离断和半月板部分切除手术来构建OA的早期模型，左膝（健侧）不做处理作为自身对照。本研究通过生物信息学方法分析其术后4周获取的两侧软骨标本的基因芯片数据。

1.2 数据预处理

利用R软件Affymetrix工具包的RMA算法（robust multiarray average algorithm）将原始的CEL文件进行质量控制和标准化处理，并转化为探针表达矩阵，然后根据GPL1355平台文件将探针名转化为基因名。

1.3 差异基因的筛选

通过R软件limma工具包（Linear Models for Microarray data）筛选出两组之间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。 log2fold change（log2FC）用于评价基因的表达水平，若P＜0.05且|log2FC|＞1可认为具有统计学差异。利用pheatmap工具包绘制热图，直观地展示每个差异基因在每个样本中的表达情况。

1.4 基因本体论和通路富集分析

基因本体论（Gene ontology，GO）是用来注释基因及其产物的常用方法，有利于集中研究感兴趣的方向，发现新的现象。日本京都基因和基因组百科全书代谢通路数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是用来分析生物功能和代谢通路的数据库。我们利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）在线工具（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）对DEGs进行GO和KEGG通路富集分析[5]。若P＜0.05则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 数据处理和DEGs筛选

基因芯片数据经标准化后以箱图形式呈现（图1）。图1b黑线基本在同一水平，表明一致性较高。经数据预处理后，R软件共筛选出170个DEGs，其中包括97个上调基因和73个下调基因（图2）。DEGs表达的热图如图3所示，可见两组样本基因表达具有显著差异。

图1 标准化之前（a）和之后（b）的基因表达数据

图2 样本基因芯片的火山图分析

2.2 GO和KEGG通路富集分析

GO可分为生物过程（biological process，BP），细胞组成（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。分别选取三类中排列前三的分析结果如表1所示，上调基因主要包括COL4A1、TNC、TNN、LAMB1、MYLPF、ACTN3等，下调基因有FABP4、ADIPOQ、FABP5、PCK1等。KEGG通路富集分析结果如表2所示。结合两者结果可以发现，上调基因主要富集在细胞外基质，并与细胞外基质交互通路等信号通路关系密切。而下调基因主要富集在肌肉收缩的生物学功能中，并与PPAR通路等信号通路关系密切。

图3 DEGs热图分析

表1 DEGs的GO分析

表2 DEGs的KEGG通路富集分析

3 讨论

近年来，关于OA样本的基因组学、转录组学和蛋白组学研究逐渐成为分子机制研究的热点[6-8]。本研究的基因芯片数据集来源于GEO数据库，我们利用生物信息学方法比较实验侧和健侧样本的差异基因表达，共筛选出170个DEGs，其中包括97个上调基因和73个下调基因。

上调基因 COL4A1、TNC、TNN、LAMB1、MYLPF、ACTN3主要富集在细胞外基质。功能富集分析显示，OA相关基因与细胞外基质受体交互通路有关。之前的研究曾指出，此信号通路在OA的进展中起着重要作用。Koelling等[9]曾报道在取自OA晚期软骨的祖细胞中，与细胞外基质受体交互通路相关的基因表达显著升高。Fei等[10]通过生物信息学分析了OA患者的关节液样本，发现在KEGG分析中，细胞外基质受体交互通路是最为相关的一条通路。同时，作者也发现COL4A1富集于此通路中。软骨细胞合成并分泌基质成分,构成了细胞生活的微环境。因此，细胞外基质成分和结构的改变可引起软骨代谢平衡稳态的破坏，从而导致OA的发生和进展。COL4A1在OA的基因芯片研究中有见报道[11-13]，但是，对于其具体导致OA发生的分子机制有待进一步研究。

下调基因FABP4、ADIPOQ、FABP5、PCK1主要富集在肌肉收缩的生物学功能中。普遍认为，在膝关节中，肌肉组织起到重要的运动和感觉功能，如活动关节、维持关节稳定性、减震缓冲，以及作为本体感受器等[14]。其中股四头肌与OA的发生和进展密切相关。有学者提出ACL损伤造成股四头肌肌力下降的原因是存在关节源性的肌肉抑制（arthrogenic muscle inhibi-tion，AMI），即ACL损伤后个体无法彻底自主活动股四头肌，因此容易使股四头肌肌力下降及萎缩[15]。股四头肌肌力下降会造成主动肌和拮抗肌的协调作用紊乱，使膝关节负荷加重，可作为OA发生的独立危险因素[16]。而OA所引起的疼痛和膝关节功能紊乱又会加重股四头肌的萎缩[17]。因此，肌肉收缩的改变与OA发生和发展互为因果。此外，KEGG通路富集分析显示，PPAR信号通路在OA中起着一定作用。最新的研究发现，过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）可能与OA的发病机制密切相关[18，19]。PPAR 包括 PPARα、PPAR β/δ、PPARγ 3个亚型，3个亚型在OA的发病中均有一定作用[20-22]。特别是PPARγ可以抑制IL-1β诱导的蛋白多糖的降解过程[23]。Vasheghani等[24]发现软骨特异性（cartilage-specific）PPARγ敲除小鼠能自发形成OA。因此，PPAR有望成为潜在的药物治疗靶点。

4 总结

综上所述，细胞外基质和肌肉收缩的改变对OA的发生发展起着关键作用。细胞外基质受体交互通路和PPAR信号通路与OA密切相关，值得进一步深入研究。

[1]Allen CR，Livesay GA，Wong EK，et al.Injury and reconstruction of the anterior cruciate ligament and knee osteoarthritis.Osteoarthritis Cartilage，1999，7（1）：110-121.

[2]Lohmander LS，Englund PM，Dahl LL，et al.The longterm consequence of anterior cruciate ligament and meniscus injuries：osteoarthritis.Am J Sports Med，2007，35（10）：1756-1769.

[3]Oiestad BE，Engebretsen L，Storheim K，et al.Knee osteoarthritis after anterior cruciate ligament injury：a systematic review.Am J Sports Med，2009，37（7）：1434-1443.

[4]Loeser RF，Goldring SR，Scanzello CR，et al.Osteoarthritis：a disease of the joint as an organ.Arthritis Rheum，2012，64（6）：1697-1707.

[5]Sherman BT，Huang Da W，Tan Q，et al.DAVID Knowledgebase：a gene-centered database integrating heterogeneous gene annotation resources to facilitate high-throughput gene functional analysis.BMC Bioinformatics，2007，8：426.

[6]Steinberg J and Zeggini E.Functional genomics in osteoarthritis：Past，present，and future.J Orthop Res，2016，34（7）：1105-1110.

[7]Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis.Nat Med，2011，17（12）：1674-1679.

[8]Ikeda D，Ageta H，Tsuchida K，et al.iTRAQ-based proteomics reveals novel biomarkers of osteoarthritis.Biomarkers，2013，18（7）：565-572.

[9]Koelling S，Kruegel J，Irmer M，et al.Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis.Cell Stem Cell，2009，4（4）：324-335.

[10]Fei Q，Lin J，Meng H，et al.Identification of upstream regulators for synovial expression signature genes in osteoarthritis.Joint Bone Spine，2016，83（5）：545-551.

[11]Olex AL，Turkett WH，Fetrow JS，et al.Integration of gene expression data with network-based analysis to identifysignalingand metabolicpathwaysregulated during the development of osteoarthritis.Gene，2014，542（1）：38-45.

[12]Lamas JR，Rodriguez-Rodriguez L，Vigo AG，et al.Largescale gene expression in bone marrow mesenchymal stem cells：a putative role for COL10A1 in osteoarthritis.Ann Rheum Dis，2010，69（10）：1880-1885.

[13]He P，Zhang Z，Liao W，et al.Screening of gene signatures for rheumatoid arthritis and osteoarthritis based on bioinformatics analysis.Mol Med Rep，2016，14（2）：1587-1593.

[14]Hurley MV.The role of muscle weakness in the pathogenesisofosteoarthritis.Rheum DisClin North Am，1999，25（2）：283-298，vi.

[15]Palmieri-Smith RM and Thomas AC.A neuromuscular mechanism of posttraumatic osteoarthritis associated with ACL injury.Exerc Sport Sci Rev，2009，37（3）：147-153.

[16]Roos EM，Herzog W，Block JA，et al.Muscle weakness，afferent sensory dysfunction and exercise in knee osteoarthritis.Nat Rev Rheumatol，2011，7（1）：57-63.

[17]Bennell KL，Wrigley TV，Hunt MA，et al.Update on the role of muscle in the genesis and management of knee osteoarthritis.Rheum Dis Clin North Am，2013，39（1）：145-176.

[18]Qu Y，Zhou L，and Wang C.Mangiferin Inhibits IL-1beta-Induced Inflammatory Response by Activating PPAR-gamma in Human Osteoarthritis Chondrocytes.Inflammation，2017，40（1）：52-57.

[19]Sacitharan PK and Vincent TL.Cellular ageing mechanisms in osteoarthritis.Mamm Genome，2016，27（7-8）：421-429.

[20]Ratneswaran A，Leblanc EA，Walser E，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor delta promotes the progression of posttraumatic osteoarthritis in a mouse model.Arthritis Rheumatol，2015，67（2）：454-464.

[21]Vasheghani F，Zhang Y，Li YH，et al.PPARgamma deficiency results in severe，accelerated osteoarthritis associated with aberrant mTOR signalling in the articular cartilage.Ann Rheum Dis，2015，74（3）：569-578.

[22]Clockaerts S，Bastiaansen-Jenniskens YM，Feijt C，et al.Peroxisome proliferator activated receptor alpha activation decreases inflammatory and destructive responses in osteoarthriticcartilage.OsteoarthritisCartilage，2011，19（7）：895-902.

[23]Francois M，Richette P，Tsagris L，et al.Activation of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha pathway potentiatesinterleukin-1 receptorantagonistproduction in cytokine-treated chondrocytes.Arthritis Rheum，2006，54（4）：1233-1245.

[24]Vasheghani F，Monemdjou R，Fahmi H，et al.Adult cartilage-specific peroxisome proliferator-activated receptor gamma knockout mice exhibit the spontaneous osteoarthritis phenotype.Am J Pathol，2013，182（4）：1099-1106.

Bioinformatics Analysis of Gene Arrays in an Early Osteoarthritis Model Induced by Anterior Cruciate Ligament Transection and Partial Medial Meniscectomy

Cai Jiangyu，Sheng Dandan，Jiang Jia，Chen Shiyi
Department of Sports Medicine，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，China

Chen Shiyi，Email：cshiyi@163.com

ObjectiveTo explore the changes in gene expression and biological process of the osteoarthritis（OA）induced by anterior cruciate ligament（ACL）transection and partial medial meniscectomy，so as to provide bioinformatic basis for further studying the molecular mechanism of OA.MethodsThe gene chip datasets of a rat model of early 0A induced by ACL transection and partial medial meniscectomy were downloaded from GEO databases（submitted by Appleton,et al.）.The differential expression genes（DEGs）were identified，and the Gene ontology（GO） as well as the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analyses for DEGs were conducted using bioinformatic methods.ResultsA total of 170 DEGs including 97 up-regulated genes and 73 down-regulated genes were identified.The up-regulated genes were mainly enriched in the extracellular matrix（ECM）and were closely related to the ECM-receptor interaction，while the down-regulated genes were mainly enriched in the biological function of muscle contraction and were linked with the peroxisome proliferators-activated receptor（PPAR） signaling pathway.ConclusionThe changes of ECM and muscle contraction play a key role in the occurrence and development of OA.The ECM-receptor interaction and PPAR signaling pathway are strongly associated with OA and worthy of further study.

osteoarthritis，differentially expressed genes，bioinformatics

2017.03.21

国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA033703)；国家自然科学基金（81572108，81370052）；国家重点研发计划项目（2016YFC1100300）

第1作者：蔡江瑜，caijiangyu1@126.com；

陈世益，Email：cshiyi@163.com