异氟醚吸入麻醉对大鼠海马脑源性神经营养因子与Bcl-2表达的影响

张亦南，朱宇航，张 超，刘德行，朱昭琼

(1.遵义医学院附属医院麻醉科，贵州遵义 563000；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义 563000)

异氟醚吸入麻醉对大鼠海马脑源性神经营养因子与Bcl-2表达的影响

张亦南1，2，朱宇航1，2，张 超1，2，刘德行1，2，朱昭琼1，2

(1.遵义医学院附属医院麻醉科，贵州遵义 563000；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义 563000)

异氟醚；海马；脑源性神经营养因子；Bcl-2

异氟醚(isoflurane，ISO)是临床常用的吸入麻醉药之一，其作用于中枢神经系统导致意识障碍、遗忘等确切麻醉效应。但ISO对学习记忆功能是否有影响，以及有怎样的影响目前仍无法定论。本研究以吸入ISO的大鼠模型为研究对象，从麻醉后海马内与认知功能密切相关的脑源性神经营养因子(BDNF)及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)分子水平入手，探讨ISO对学习记忆的影响，分析其影响是否与海马内的重要蛋白有着直接或间接的联系，为全身麻醉后认知功能障碍的研究提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1实验大鼠与分组 清洁级SD大鼠54只，体质量(360±25)g，分为对照组(n=6)、氧气(O2)组(n=24)和ISO组(n=24)。根据取材时间不同(6、12、24、72 h)再将O2组和ISO组各分为4个亚组，每组6只大鼠。

表1 大鼠麻醉前后SpO2及呼吸频率比较

*：P<0.05，与麻醉前比较

1.2方法

1.2.1构建大鼠模型 自制吸入麻醉箱主要由麻醉机、麻醉箱、气体检测仪3个部分组成，将麻醉箱连接于麻醉呼吸机螺纹管回路中，麻醉呼吸机工作状态为手控模式，调节排气阀接近最小压力，调节麻醉机ISO挥发罐输出浓度为3%行麻醉诱导，麻醉机输出O2总流量为2 L/min，接气体监测仪监测麻醉箱中O2、二氧化碳(CO2)、ISO等气体的浓度，待大鼠翻正反射消失后调节ISO挥发罐至所需要的维持浓度，在此过程中，应用气体浓度检测仪对箱内浓度进行检测，保证箱内浓度的稳定性和准确性。3组大鼠均在实验前进行环境适应1周，将实验大鼠每日放入自制的大鼠吸入麻醉箱内15 min，不进行任何处理，以减少活动环境变化对实验大鼠的影响。1周后，对照组直接处死留取标本；O2组均给予吸入40% O2和空气混合气体1 h；ISO组均应用3% ISO诱导，待翻正反射消失后再吸入1.8% ISO，维持1 h，麻醉过程中吸入40% O2，分别于麻醉前、诱导后、麻醉后30 min、麻醉后60 min、苏醒即刻观察大鼠呼吸频率及经皮血氧饱和度(SpO2)。ISO组和O2组分别于6、12、24、72 h后处死大鼠取标本(各6只)。

1.2.2观察指标与检测方法

1.2.2.1大鼠基础数据和麻醉中的生命体征 整个实验过程始终保持环境温度在28～30 ℃，湿度50%～80%。麻醉过程中观察所有实验大鼠肢端部位、尾部和鼻唇颜色，确定是否出现发绀等缺氧现象；为避免实验结果受麻醉缺氧等干扰因素影响，分别于麻醉前、诱导后、麻醉30 min、60 min及苏醒即刻抽取6只大鼠检测并记录其SpO2和呼吸频率。

1.2.2.2主要观察指标的检测 1周适应环境后，将O2组(n=24)、ISO组(n=24)按上述方法在麻醉箱内吸O2或ISO麻醉，分别于自然清醒6、12、24、72 h后经腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后断头取脑，于冰上快速剥离脑组织，取海马组织称质量后，按50～100 mg组织加入1 mL Trizol溶液，置入1.5 mL EP管，半定量反转录PCR(RT-PCR)法检测大鼠海马中BDNF及Bcl-2 mRNA的表达。对照组直接处死(方法和取材同O2组和ISO组)。

2 结 果

2.1大鼠麻醉前后生命特征 所有实验大鼠在麻醉诱导及维持过程中均无明显发绀、缺氧表现，无大鼠死亡。大鼠SpO2测量结果显示：诱导后、麻醉后30、60 min与麻醉前比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。大鼠呼吸频率监测结果显示：诱导后、麻醉后30、60 min及苏醒即刻与麻醉前比较均有不同程度的降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2大鼠海马BDNF mRNA表达水平比较 ISO组大鼠BDNF mRNA表达水平在12、24 h均低于O2组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。ISO组大鼠BDNF mRNA表达水平在12、24 h均低于对照组(110.27±8.99)，差异均有统计学意义(P<0.05)。ISO组大鼠海马BDNF mRNA表达水平随时间的变化趋势见图1。

表2 不同时间点ISO组与O2组大鼠海马BDMF mRNA表达水平比较

*：P<0.05，与O2组比较

图1 ISO组大鼠海马BDMF mRNA表达水平变化趋势

2.3大鼠海马Bcl-2 mRNA表达水平比较 与O2组比较，ISO组大鼠Bcl-2 mRNA表达水平在6、12、24、72 h分别有不同程度的下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。大鼠Bcl-2 mRNA表达水平在6、12、24、72 h均低于对照组(118.62±9.31)，差异有统计学意义(P<0.05)。ISO组大鼠海马Bcl-2 mRNA表达水平随时间的变化趋势见图2。

表3 不同时间点ISO组与O2组大鼠海马Bcl-2 mRNA表达水平比较

*：P<0.05，与O2组比较

图2 ISO组大鼠海马Bcl-2 mRNA表达水平变化趋势

3 讨 论

本研究以ISO麻醉大鼠模型为实验对象。由于按标准夹尾法测定的大鼠ISO最低肺泡有效浓度(MAC)约为1.8%[1]，因此本实验选取ISO维持浓度为1.8%，并在整个麻醉过程中监测麻醉大鼠的生命体征、SpO2和呼吸频率。结果发现，麻醉诱导后及麻醉维持阶段，大鼠呼吸频率较麻醉前及麻醉苏醒时有明显降低，但整个麻醉过程中均吸入O2和ISO混合气体，充分供氧后整个过程中SpO2并无大幅度改变，确保实验大鼠ISO麻醉的安全性，同时对实验的质量控制提供保障。

BDNF是海马新突触发生、改建及传递效能等功能的重要调节因子，在突触可塑性的变化中发挥重要作用[2-3]；而bcl-2是重要的抗凋亡基因，它可稳定线粒体，阻断内质网释放钙离子(Ca2+)，调节线粒体信号分子的转导，最终中断DNA凋亡，保护细胞[4]。前者对于促进神经元再生、分化成熟，以及突触传递和可塑性起重要调控作用，后者则是抗神经细胞凋亡的主要参与因子。同时有研究提出，二者联系密切，Bcl-2家族的调节可能是BDNF抵抗神经元凋亡的机制之一[5]。

由此，本研究以吸入ISO全身麻醉大鼠为研究对象，提取吸入ISO后不同时间点大鼠海马组织，检测BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA水平，结果显示：相同时间点ISO组与O2组大鼠比较，BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA表达水平均有不同程度的降低，其中BDNF mRNA表达水平在麻醉后12、24 h下降明显，Bcl-2 mRNA表达水平在麻醉后6、12、24、72 h均下降明显。本研究中设定O2组以避免O2对神经细胞的影响，因此O2浓度与ISO组麻醉过程中的吸氧浓度相同，均为40%，使两组条件位于同一水平，增加比较的可靠性。此外，为了研究随时间推移海马内神经因子的改变，设定对照组并进行比较，结果显示：BDNF mRNA和Bcl-2 mRNA表达水平均于麻醉后6 h开始下降，72 h开始恢复，不同的是前者于麻醉后12、24 h下降明显，而后者在麻醉后6、12、24、72 h与对照组比较均明显降低。根据上述研究结果推测，吸入ISO全身麻醉可能引起海马内神经突触发生一过性改变，同时引发神经元细胞的凋亡，这与Dalla Massara等[6]的研究结果相似，认为ISO麻醉会导致BDNF和表观遗传组蛋白的改变。

影响BDNF及Bcl-2水平变化的因素有多种。有研究表明，增加体内谷氨酸的成份，可进一步促使组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)从神经元细胞突触前囊泡释放，使BDNF前体(proBDNF)裂解为成熟的BDNF[7]；上游刺激因子2及甲基化CpG结合蛋白等多种转录因子也将对BDNF的转录调控发挥重要功能[8]；BDNF还可能作为一种自分泌激活物，进一步加强自身的活化[9]；同时，当神经细胞因外界因素受到一定损伤时，机体调动内源性保护机制，通过激活Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)通路，抑制半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)而增加Bcl-2的表达。以上因素均可影响BDNF及Bcl-2在机体中的表达，但其是否在吸入ISO后对BDNF及Bcl-2的恢复起作用，还需进一步研究。

目前研究认为，ISO对大脑的抑制作用主要是抑制突触前谷氨酸释放、增强谷氨酸再摄取，以及抑制由N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)介导的兴奋性突触后电位[10-11]。其中，NMDAR为神经元突触传递的长时程增强(long-term potentiation，LTP)的重要离子型通道受体，而LTP则是目前公认的学习、记忆的神经基础之一，是研究学习与记忆的理想模式，它的激活可进一步激活cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)信号传导通路，调节BDNF转录，直接影响海马突触的塑形及功能，而BDNF也能诱导CREB的磷酸化，进一步加强CREB传导功能，形成正反馈循环通路[12]。此环路可增加Bcl-2的合成，进一步影响突触可塑性和神经元的生存[13]。越来越多的研究证实，脑内BDNF与Bcl-2水平的关系密切[14]。本研究显示，在吸入ISO 72 h内BDNF和Bcl-2发生一过性改变，可能进一步抑制CREB传导通路，最终导致LTP的一过性抑制，进而对大脑的学习记忆功能产生抑制作用。这与Jevtovic-Todorovic等[15]的研究相似，认为新生期大鼠在进行ISO麻醉后，可出现大脑神经元细胞的凋亡并诱导LTP的抑制。此外，Gentry等[16]认为，在新生期接受ISO麻醉后，其认知功能和行为学的改变将持续至成年。

本研究也存在一定不足，笔者将进一步研究与认知功能相关的其他突触抑制蛋白，同时选用其他定性、定量的实验手段，更深入地分析ISO全身麻醉对海马及认知功能的影响。

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EffectsofisofluraneinhalationanesthesiaontheexpressionsofBDNFandBcl-2inrathippocampus*

ZhangYinan1，2，ZhuYuhang1，2，ZhangChao1，2，LiuDexing1，2，ZhuZhaoqiong1，2

(1.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563000,China；2.GuizhouKeyLaboratoryofBasicResearchforAnesthesiaandOrganProtection,Zunyi,Guiyang563000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of isoflurane (ISO) inhale anesthesia on the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and Bcl-2 of hippocampal in rats.MethodsA total of 54 SD rats were divided into 3 groups:control group (n=6),O2group (n=24) and ISO group (n=24).All rats were given 1 week to adapt the environment.Then,rats in the control group were directly sacrificed to collect hippocampi specimens;rats in the O2group inhaled mixed gas containing 40% O2and air for 1 hour;rats in the ISO group anesthetized with 3% ISO and maintained for 1 h with 1.8% ISO after righting reflex disappeared,inhaling 40% O2in the whole process of anesthesia.Respiratory rate and percutaneous oxygen saturation (SpO2) of the rats were observed before anesthesia,after induction,30 min after anesthesia,60 min after anesthesia and at the moment of analepsia,respectively.Rats in the O2group and ISO group were sacrificed to extract hippocampi specimens at 6,12,24 and 72 h after treatment,respectively.The BDNF and Bcl-2 mRNA expression levels in hippocampus of rats were detected using the semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared to that before anesthesia,the respiratory rates after induction,30 min after anesthesia and 60 min after anesthesia were decreased (P<0.05),while no apparent changes was found in the SpO2(P>0.05).Compared to the O2group,the relative expressions of BDNF mRNA in hippocampi of rats in the ISO group were obviously decreased at 12 and 24 h after the treatment (P<0.05).After anesthesia,the relative expression of BDNF mRNA in rat hippocampus in the ISO group was decreased as time goes on,and the expression levels at 12 and 24 h after the treatment were lower than those in the control group (P<0.05).Compared to the O2group and control group,the relative expression levels of Bcl-2 mRNA in hippocampi of the rats in the ISO group were lower at all time points for detection (P<0.05).ConclusionISO can generate transient inhibition effect on expressions of BDNF and Bcl-2 in hippocampus of rat.

isoflurane；hippocampus；brain-derived neurotrophic factor；Bcl-2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.004

贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字LKZ[2011]29)。

张亦南(1978-)，副主任医师，硕士，主要从事认知功能及心血管麻醉研究。

目的观察异氟醚(ISO)吸入麻醉对大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)分子表达的影响。方法将54只SD大鼠分为对照组(n=6)、氧气(O2)组(n=24)和ISO组(n=24)，对照组直接处死留取标本，O2组给予吸入40% O2和空气混合气体1 h，ISO组以3% ISO诱导麻醉并以1.8% ISO维持1 h。分别于麻醉前、诱导后、麻醉后30 min、麻醉后60 min、苏醒即刻观察大鼠呼吸频率及经皮血氧饱和度(SpO2)。O2组和ISO组分别于处理后6、12、24、72 h处死大鼠取海马，采用半定量反转录PCR(RT-PCR)检测海马BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA的表达。结果大鼠呼吸频率在诱导后及麻醉后30、60 min较麻醉前均有不同程度降低(P<0.05)；SpO2在诱导后、麻醉后30、60 min及苏醒即刻与麻醉前比较，差异无统计学意义(P>0.05)。ISO组大鼠海马BDNF mRNA表达水平与O2组比较在麻醉后12、24 h降低(P<0.05)；麻醉后ISO组大鼠海马BDNF mRNA表达水平随时间呈下降趋势，在12、24 h明显低于对照组(P<0.05)。ISO组大鼠海马Bcl-2 mRNA表达水平在所有时间点均低于对照组与O2组(P<0.05)。结论ISO麻醉可对大鼠海马BDNF及Bcl-2的表达产生抑制作用。

R614.2

A

1671-8348(2017)29-4044-03

2017-03-22

2017-06-20)