银翘柴黄颗粒质量控制方法研究

张丽先，王学方，曹静亚，李晓，李自红，李飞飞，李智宁，宁二娟，宋梦娇，魏悦



银翘柴黄颗粒质量控制方法研究

张丽先1，2，王学方2，3，曹静亚1，2，李晓2，3，李自红1，2，李飞飞1，2，李智宁1，2，宁二娟1，2，宋梦娇1，2，魏悦1，2

1.河南科高中标检测技术有限公司，河南郑州 450000；2.河南省生物技术开发中心，河南郑州450000； 3.河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司，河南郑州 450002

建立银翘柴黄颗粒质量控制方法。采用薄层色谱法鉴别银翘柴黄颗粒中金银花、柴胡、黄芩及甘草，HPLC测定连翘酯苷A的含量。在选定的色谱条件下，薄层色谱斑点清晰、分离度好，阴性对照未见干扰。含量测定连翘酯苷A在0.029 6～0.474 µg范围内线性关系良好，平均回收率为99.73%，RSD＝1.18%。本方法准确、简便，能够有效控制银翘柴黄颗粒的质量。

银翘柴黄颗粒；质量控制；薄层色谱法；高效液相色谱法；含量测定

银翘柴黄颗粒是基于银翘散辛凉透表、清热解毒的功效和小柴胡汤和解少阳、和胃降逆的功效[1-2]，通过不同药味间合理加减、调剂组方制备而成的颗粒剂。该方剂由连翘、金银花、柴胡、黄芩、甘草等7味中药组成，具有清热、抗炎、抑菌、抗感染、抗氧化、抗病毒、解热镇痛的功效。连翘作为君药，用量较大，连翘酯苷A为连翘中含量较高的主要活性成分之一，具有与复方制剂相似的功效，如抗氧化、抗菌、抗感染、解热等[3-4]。

该制剂药味众多，成分复杂，为更好地控制银翘柴黄颗粒的质量一致性，保证用药安全有效，本试验采用薄层色谱法对银翘柴黄颗粒复方制剂中金银花、柴胡、黄芩和甘草进行定性鉴别，同时采用HPLC对银翘柴黄颗粒制剂中主要有效成分连翘酯苷A进行定量测定，结合定性鉴别和含量测定建立银翘柴黄颗粒质量控制方法。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津），KH5200型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），ME-204型微量分析天平（赛多利斯公司），YELA SB-2000型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），HH4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），Good-See-20E上海科哲成像系统。

3批银翘柴黄颗粒（批号20140801、20140802、20140803，依次编号为1、2、3），河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司提供。对照药材金银花（批号121060-201208）、黄芩（批号120955-201309）、柴胡（批号120992-201209）、甘草（批号120904- 201319），中国食品药品检定研究院；对照品绿原酸（批号110753-200413）、黄芩苷（批号110715- 200815）、柴胡皂苷a（批号110831-200302）、柴胡皂苷d（批号110778-200506）、甘草苷（批号111610- 201106）、连翘酯苷A（批号111810-201001），中国食品药品检定研究院；硅胶G板、硅胶H板及聚酰胺板，青岛海洋化工厂；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 金银花 分别取本品0.5 g，加甲醇15 mL，放置12 h，过滤，滤液作为供试品溶液，编号为1～3。另取金银花对照药材及按处方工艺制成的不含金银花的样品，同上法制成对照药材溶液、阴性供试液。再取绿原酸对照品10 mg，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各6 µL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365 nm紫外光灯下检视。3批供试品色谱中在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点。在与对照药材色谱相应的位置上显3个相同颜色的斑点，供试品平行性良好，阴性供试液无干扰。

2.1.2 黄芩 分别取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，加热回流30 min，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，上清液作为供试品溶液，编号为1～3。另取黄芩对照药材及按处方工艺制成的不含黄芩的样品，同法制成对照药材溶液、阴性供试液。再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2 µL，点于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%FeCl3乙醇溶液，分别置日光和365 nm紫外光灯下检视。3批供试品色谱和黄芩苷对照品及对照药材色谱相应的位置显相同的暗色斑点，黄芩苷分离度欠佳，供试品平行性良好，阴性供试液有干扰。

2.1.3 柴胡 分别取本品1 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤1次，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液，编号为1～3。另取柴胡对照药材及按处方工艺制成的不含柴胡的样品，同法制成对照药材溶液、阴性供试液。再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品，分别加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.5 mg、柴胡皂苷d 0.5 mg的对照品溶液，另配制每1 mL含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d各0.5 mg的混合对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60 ℃加热至斑点显色清晰，置365 nm紫外光灯下检视。3批供试品色谱在对照药材、对照品显色位置处显相同颜色斑点，其中柴胡皂苷d显色明显，柴胡皂苷a色彩暗淡，供试品平行性良好，阴性供试液无干扰。

2.1.4 甘草 分别取本品1 g，加乙醚40 mL，加热回流1 h，过滤，弃去乙醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液，编号为1～3。另取甘草对照药材及按处方工艺制成的不含甘草的样品，同法制成对照药材溶液和阴性供试液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置365 nm紫外光灯下检视。3批供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，供试品平行性良好，阴性供试液无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 采用Venusil XBP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈-0.5%醋酸水溶液（15∶85）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长330 nm，进样量10 µL。色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备 准确称取连翘酯苷A对照品7.4 mg，以70%甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得浓度为296 µg/mL的连翘酯苷A对照品溶液（临用新制）。

2.2.3 供试品溶液的制备 取银翘柴黄颗粒0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）10 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。将供试品溶液过0.22 µm微孔滤膜，置于1.5 mL进样小瓶中，待液相分析。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取除连翘外的其余药味，按工艺要求制成不含连翘的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取连翘酯苷A对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，70%甲醇定容，摇匀。在“2.2.1”项色谱条件下检测，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，得连翘酯苷A的线性方程＝1555750－6632.1，2＝0.999 9。连翘酯苷A在0.029 6～0.474 µg范围内线性关系良好。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

2.2.6 精密度试验 取浓度为11.84 µg/mL的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，重复进样6次，峰面积RSD＝0.76%，表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于制样后0、4、8、12、24 h进样分析，结果连翘酯苷A含量RSD＝1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件检测，连翘酯苷A的平均含量为0.67%，RSD＝1.62 %，表明本法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取样品6份，每份准确称取0.1 g，加入一定量的连翘酯苷A对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 连翘酯苷A加样回收率试验

2.2.10 样品含量测定 取样品3批，按“2.2.3”项下方法处理，每批3个平行样，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以外标法计算出连翘酯苷A的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（%，n＝3）

3 讨论

参照药典方法[5]221能够实现银翘柴黄颗粒中金银花的鉴别，绿原酸分离度良好。黄芩的薄层鉴别方法众多，药典以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）为展开剂[5]301，谢东等[6]以乙酸为展开剂，其中以36%醋酸展开后斑点明显，黄芩苷分离度较其他方法有提高，但仍然未能实现黄芩苷与邻近斑点完全分离，拖尾现象依然明显，阴性供试液在黄芩苷显色处有干扰，故黄芩的薄层鉴别有待进一步研究。杂质对于柴胡的鉴别干扰严重，通过优化前处理方法[7]，提高供试液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度，有效改善了分离效果，柴胡皂苷d显色明显，可将其作为柴胡鉴别的对照品。药典以甘草酸铵作对照品为甘草鉴别的方法[5]87对本处方不适用，本试验以甘草苷作为甘草鉴别的对照品，供试品溶液与对照品、对照药材显相同颜色的斑点，阴性供试液未见干扰。

本试验对于连翘酯苷A含量测定，考察了不同比例甲醇对连翘酯苷A的溶出度。流动相选择方面，比较了甲醇-水、乙腈-水、不同比例对乙酸对连翘酯苷A分离度及色谱峰对称性的影响。最终选择70%甲醇为提取溶剂，乙腈-0.5%乙酸为流动相，通过一系列的方法学考察以及样品测定表明本方法稳定可靠。

本试验通过银翘柴黄颗粒中多味中药的定性鉴别，避免了单一药味鉴别的片面性，较好实现了对复方制剂的全面把控，同时结合银翘柴黄颗粒中活性成分连翘酯苷A含量测定方法，能够对银翘柴黄颗粒的质量进行有效控制。

[1] 陈巧谋,黄礼杰,王炜.银翘散的临床应用与药理实验研究[J].中医药导报,2003,9(9)：37-39.

[2] 曹秋梅,许周洁,聂源,等.浅析小柴胡汤近十年药理研究与临床应用[J].亚太传统医药,2017,13(2)：76-77.

[3] 郑江萍,叶正德,梁俊,等.连翘药材及其配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷含量比较[J].中国中医药信息杂志,2014,21(11)：88-91.

[4] 孟祥乐,李俊平,李丹,等.连翘的化学成分及其药理活性研究进展[J].中国药房,2010,21(43)：4117-4118.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015.

[6] 谢东,路玫.薄层扫描法测定抗毒利咽口服液中黄芩苷的含量[J].西北药学杂志,2000,15(4)：151-152.

[7] 赵志军,王连水.小柴胡颗粒薄层鉴别及黄芩苷含量测定方法的研究[J].中国实验方剂学杂志,2005,11(3)：22-23.

Study on Quality Control Method ofGranules

ZHANG Li-xian1,2, WANG Xue-fang2,3, CAO Jing-ya1,2, LI Xiao2,3, LI Zi-hong1,2, LI Fei-fei1,2, LI Zhi-ning1,2, NING Er-juan1,2, SONG Meng-jiao1,2, WEI Yue1,2

To establish the quality control method ofGranules.Lonicerae Japonicae Flos, Bupleuri Radix, Scutellariae Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma inGranules were identified by TLC, and the content of forsythoside A was detected by HPLC.Under the selected chromatographic conditions, TLC spots were clear, the separating was good, and non-interference was found in negative control. Forsythoside A in calibration curve showed good linearity in the range of 0.029 6–0.474 µg, with average recovery of 99.73%, RSD=1.18%.The method is accurate and simple, which can be used for the quality control ofGranules.

Granules; quality control; TLC; HPLC; content determination

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.020

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0082-04

（2017-04-19）

（2017-05-09；编辑：陈静）

河南省科技攻关项目（152102110115）