样品处理方法对皖南葛根和粉葛中总黄酮和葛根素含量的影响

常跃兴，郭爱灵，陈铎葆，邓云，张荣波，姚斯琪



样品处理方法对皖南葛根和粉葛中总黄酮和葛根素含量的影响

常跃兴，郭爱灵，陈铎葆，邓云，张荣波，姚斯琪

安徽理工大学医学院药学系，安徽淮南 232001

建立葛根和粉葛中总黄酮和葛根素含量测定方法，比较室温超声法、超声加热法和加热回流法等样品处理方法对葛根和粉葛中总黄酮和葛根素含量测定结果的影响。总黄酮含量测定采用紫外分光光度法，在波长250 nm处测定吸光度；葛根素含量测定采用HPLC，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水（25∶75），检测波长为250 nm，流速为1.0 mL/min。室温超声法、加热回流法和超声加热法葛根中总黄酮含量分别为15.09%、14.48%、12.71%（＝3），葛根素含量分别为4.37%、4.09%、3.80%（＝3）；粉葛中总黄酮含量分别为2.09%、2.23%、2.17%（＝3），葛根素含量分别为0.50%、0.53%、0.52%（＝3）。室温超声法、超声加热法可替代加热回流法分别用于葛根和粉葛中总黄酮和葛根素含量测定时供试液制备；皖南野生葛根和粉葛中葛根素含量均符合药典标准。

供试液制备；葛根；粉葛；总黄酮；葛根素；含量测定

葛属植物资源分布较广且蕴含量较大的是野葛和甘葛藤[1]，二者自2005年版《中华人民共和国药典》开始分别以葛根和粉葛分开收载。二者所含异黄酮类成分是其主要有效成分[2]，而葛根素是其最主要的活性成分[3]。历版药典亦以葛根素含量作为质量控制的标准。现代研究表明，不同产地野生葛根和粉葛所含黄酮类成分和葛根素含量均有较大差异[4]，甚至产地为山西运城、大同和晋城的野葛所含葛根素含量最大者为4.48%，最小者仅为1.46%[5]。本研究采集安徽芜湖野葛和甘葛藤，建立其总黄酮和葛根素含量测定方法，比较室温超声法、超声加热法和加热回流法等样品处理方法对其总黄酮和葛根素含量测定的影响。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）；Diamonsil Plus C 18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，迪马公司）；KQ-100 DE型超声波清洗器（工作频率为40 kHz，试验过程中超声功率均为100 W，昆山超声仪器有限公司）；MS105DU型十万分之一天平（梅特勒托利多国际贸易上海有限公司）；BSM220.4型分析天平（上海精卓电子科技有限公司）；DE-100 G型多功能小型粉碎机（浙江红景天工贸有限公司）。

葛根和粉葛，采自安徽省芜湖市芜湖县境内山坡，趁鲜切成厚片或小块，干燥备用，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定，分别为豆科植物野葛（Willd.）Ohwi和甘葛藤Benth.的干燥根；葛根素对照品（批号110752-201514，供含量测定用），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），美国Merk公司；水（超纯水）；无水乙醇（分析纯），国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 紫外分光光度法测定总黄酮含量

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品16.7 mg，置于200 mL容量瓶中，加入30%乙醇适量，超声助溶，定容至刻度，摇匀，即得浓度为83.5 µg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取适量备用葛根或粉葛厚片，采用粉碎机将其粉碎成全部过3号筛的细粉。分别精密称取葛根0.1 g和粉葛0.8 g置于不同具塞锥形瓶中，各用50 mL移液管精密加入30%乙醇50 mL，称定质量，室温超声、加热回流或超声加热（75 ℃±5 ℃）30 min，取出，放凉至室温，再称定质量，用30%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液Ⅰ，备用。取200 µL供试品溶液Ⅰ，置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液Ⅱ。

2.1.3 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下葛根素对照品溶液500、700、900、1100、1300 µL，分别置于10 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，摇匀，即得系列不同浓度的葛根素对照品溶液，以30%乙醇为空白对照，于波长250 nm处测定吸光度。以葛根素浓度C（µg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标作标准曲线，进行回归分析，得回归方程＝0.065＋0.002，＝0.999。结果表明葛根素对照品在4.175～10.855 µg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 精密量取“2.1.1”项下葛根素对照品溶液500、900、1300 µL，分别置于10 mL容量瓶中，以30%乙醇定容至刻度，摇匀，即得低、中、高浓度的葛根素对照品溶液，以30%乙醇为空白对照，于波长250 nm处测定吸光度，重复测定6次，得低、中、高浓度葛根素对照品溶液吸光度的RSD分别为0.43%、0.31%、0.80%。结果表明，紫外分光光度法测定葛根素吸光度精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一批葛根或粉葛供试品溶液Ⅱ，分别于0、2、4、8、16、24 h在波长250 nm处测定吸光度，结果葛根或粉葛供试品溶液Ⅱ吸光度的RSD分别为1.76%、1.34%，表明葛根或粉葛供试品溶液Ⅱ在24 h内具有良好的稳定性。

2.1.6 重复性试验 分别精密称取同一批次6份葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，按“2.1.2”项下方法分别采用室温超声法和超声加热法制备供试品溶液Ⅰ和供试品溶液Ⅱ，取供试品溶液Ⅱ在250 nm波长处分别测定吸光度。根据吸光度计算葛根中总黄酮平均含量为15.10%，RSD＝2.47%；粉葛中总黄酮平均含量为2.18%，RSD＝2.34%。结果表明本方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 分别精密称取已知总黄酮含量的葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各3份，分别置于100 mL锥形瓶中，各精密加入一定浓度的葛根素对照品溶液50 mL，分别按“2.1.2”项下方法采用室温超声法和超声加热法制备供试品溶液Ⅱ，于250 nm波长处测定吸光度，计算加样回收率，结果见表1。可见，葛根和粉葛中总黄酮含量测定准确度符合测定要求，该方法可用于本试验。

2.1.8 样品含量测定 分别精密称定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分别按“2.1.2”项下室温超声、加热回流或超声加热法制备供试品溶液Ⅰ和供试品溶液Ⅱ，取供试品溶液Ⅱ分别于250 nm波长处测定吸光度，并计算葛根和粉葛中总黄酮含量，结果见表2。

表1 葛根和粉葛中总黄酮加样回收率试验

表2 葛根和粉葛中总黄酮含量测定结果（%，n＝3）

2.1.9 数据处理与分析 采用SPSS19.0软件对“2.1.8”项下数据进行两两均数比较。结果在葛根的总黄酮含量测定中，室温超声法与加热回流法无显著差异（＞0.05），而二者均与超声加热法有显著差异（＜0.05）；在粉葛的总黄酮含量测定中，加热回流法与超声加热法无显著差异（＞0.05），而二者均与室温超声法有显著差异（＜0.05）。

2.2 HPLC测定葛根素含量

2.2.1 色谱条件 流动相为甲醇-水（25∶75），检测波长为250 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为室温。色谱图见图1。按葛根素峰计算，理论塔板数不低于4000。

注：S1.野葛室温超声；S2.野葛加热回流；S3.野葛超声加热； S4.粉葛室温超声；S5.粉葛加热回流；S6.粉葛超声加热； 1.葛根素；B.空白；R.对照品

2.2.2 对照品溶液的制备 采用“2.1.1”项下浓度为83.5 µg/mL的葛根素对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 采用“2.1.2”项下制备的供试品溶液Ⅰ。

2.2.4 线性关系考察 精密称定12.0 mg葛根素对照品，置于50 mL容量瓶，加30%乙醇适量，超声助溶，继续加30%乙醇至刻度，振摇混匀，作为葛根素含量测定线性及其范围的母液。分别精密量取上述母液5、2、1 mL和500 µL，分别置于10 mL容量瓶，加30%乙醇至刻度，振摇混匀，连同母液一起作为葛根素含量测定线性及其范围的系列浓度溶液。分别精密吸取上述溶液各20 µL注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行含量测定，记录葛根素峰面积值。以葛根素浓度为横坐标，葛根素峰面积为纵坐标，作标准曲线，计算回归方程。结果葛根素浓度在12～240 µg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为＝47.16＋5.322（＝0.999），满足葛根素含量测定要求。

2.2.5 精密度试验 分别精密吸取浓度为12、48、240 µg/mL的葛根素对照品溶液20 µL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，重复进样6次，记录峰面积，结果3个浓度对应峰面积RSD分别为0.84%、0.97%、1.41%，表明该仪器测定葛根素含量精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一批葛根或粉葛供试品溶液Ⅰ，于制备后分别放置0、6、12、18、24、30 h，精密吸取20 µL，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算葛根素峰面积RSD分别为3.78%、4.04%，表明葛根和粉葛供试品溶液在30 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取“2.1.6”项下制备的供试品溶液Ⅰ，进样20 µL，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。葛根中葛根素平均含量为4.38%，RSD＝2.13%；粉葛中葛根素平均含量为0.52%，RSD＝1.47%。结果表明葛根和粉葛供试品溶液制备方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取“2.1.8”项下制备的供试品溶液Ⅰ，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，结果见表3。表明葛根和粉葛中葛根素含量测定准确度符合测定要求，该含量测定方法可用于本试验。

2.2.9 样品含量测定 分别精密称定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分别按“2.1.2”项下室温超声、加热回流或超声加热法制备供试品溶液Ⅰ，在上述色谱条件下，分别精密吸取上述葛根素对照品溶液与各供试品溶液20 µL，进样测定峰面积积分值，计算葛根素含量，结果见表4。

表3 葛根和粉葛中葛根素加样回收率试验

表4 葛根和粉葛中葛根素含量测定结果（%，n＝3）

2.2.10 数据处理与分析 采用SPSS19.0软件对“2.2.9”项下数据进行两两均数比较。结果在葛根的葛根素含量测定中，室温超声法、加热回流法、超声加热法三者差异均有统计学意义（＜0.05）；在粉葛的葛根素含量测定中，加热回流法与超声加热法无显著差异（＞0.05），而二者均与室温超声法有显著差异（＜0.05）。

3 讨论

葛根素含量测定结果表明，本试验所采葛根和粉葛均符合2015年版《中华人民共和国药典》葛根中葛根素含量不得低于2.4%和粉葛中葛根素含量不得低于0.3%的要求，因此皖南野生葛根和粉葛均达到药用要求，可对其药用资源进行可持续性开发。

本研究葛根中总黄酮含量达15.08%，与文献报道的葛根中总黄酮含量6.20%～15.87%[1]，以及山西葛根含量为12.53%[6]相差不大；而粉葛总黄酮含量2.17%，亦在文献报道的含量0.24%～3.67%范围内。

综合权衡“2.1.9”和“2.2.10”项下结果，葛根总黄酮和葛根素含量测定中供试品制备方法提示以室温超声提取法替代加热回流提取法，不仅含量较高，而且节约能源，操作简单；粉葛总黄酮和葛根素含量测定中，综合考虑节约能源和操作简单等因素，可用超声加热提取法替代加热回流提取法。葛根和粉葛总黄酮和葛根素含量测定结果变化趋势基本一致，仅在室温超声与加热回流制备供试品溶液方法方面不一致，可能是由于总黄酮含量与葛根素含量差异较大引起的。

本研究中的总黄酮含量测定用葛根和粉葛供试品溶液制备是在葛根素含量测定用葛根和粉葛供试品溶液基础上进行了稀释，避免了供试品溶液制备的重复，节约了制备时间；同时采用超声法处理样品比用加热回流法简单，亦节约了时间。因此，本试验所采用的葛根和粉葛中总黄酮和葛根素供试品溶液制备方法较为简单，可为含葛根或粉葛制剂或复方中总黄酮和葛根素的含量测定提供借鉴。

[1] 陶娟,许慕农,路秋生,等.中国葛属植物资源和利用情况[J].中国野生植物资源,2007,26(3)：38-41.

[2] 曹钟灵,李建北,张东明.葛属植物中异黄酮类化合物的研究进展[J].中药材,2005,28(1)：67-71.

[3] 楚纪明,马树运,李海峰,等.葛根有效成分及其药理作用研究进展[J].食品与药品,2015,17(2)：142-146.

[4] 肖培根,李大鹏,黄世林.新编中药志：第1卷[M].北京：中国医药科技出版社,2002：962-975.

[5] 张静,郝建平,王峰,等.6种晋产野生葛根中葛根素、大豆苷和总黄酮含量比较[J].天然产物研究与开发,2015,27(1)：99-102.

[6] 刘计权,刘亚明,裴香萍.山西产葛根总黄酮及3种异黄酮含量的测定[J].中华中医药杂志,2012,27(2)：309-312.

Effects of Different Sample Preparation Methods on Total Flavonoids and Puerarin Content from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province

CHANG Yue-xing, GUO Ai-ling, CHEN Duo-bao, DENG Yun, ZHANG Rong-bo, YAO Si-qi

To establish UV spectrophotometry and HPLC methods for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix; To compare the ultrasonic method at room temperature, conventional refluxing method and ultrasonic method at heating conditions at the aspect of content determinations.The content determinations of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry at 250 nm; the content of puerarin was determined by HPLC with octadecylsilane-bonded silica gel as the stationary phase, a mixture of methanol and water (25:75) as the mobile phase, 256 nm as the detection wavelength, 1.0 mL/min as the flow rate.Contents of total flavonoids in Puerariae Lobatae Radix by ultrasonic method at room temperature, conventional refluxing method and ultrasonic method were15.09%, 14.48%, and 12.71% (=3), respectively. The contents of puerarin were 4.37%, 4.09%, and 3.80% (=3), respectively. Contents of total flavonoids in Puerariae Thomsonii Radix were 2.09%, 2.23%, and 2.17% (=3), respectively. The contents of puerarin were 0.50%, 0.53%, and 0.52% (=3), respectively.Ultrasonic method at room temperature can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix, and ultrasonic method at heating conditions also can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids puerarin from Puerariae Thomsonii Radix. Puerarin contents from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province are all in line with the Pharmacopoeia standards.

sample preparation; Puerariae Lobatae Radix; Puerariae Thomsonii Radix; total flavonoids; puerarin; content determination

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.019

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0078-04

（2017-03-30）

（2017-04-24；编辑：陈静）

2015年安徽理工大学引进人才基金项目（11079）；安徽理工大学大学生创新创业训练计划项目（201610361317）