HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中奥美拉唑及其代谢物

王 曼， 王鸿芡， 秦永平， 梅亚君， 南 峰， 向 瑾， 余 勤，梁茂植，张 梅，罗明军

（1.成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2.四川大学华西医院国家药物临床试验机构临床药理研究室，四川 成都 610041；3.重庆赛诺生物药业股份有限公司，重庆 401554)

HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中奥美拉唑及其代谢物

王 曼1，2， 王鸿芡2， 秦永平2， 梅亚君1，2， 南 峰2， 向 瑾2， 余 勤2，梁茂植2，张 梅1，罗明军3

（1.成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2.四川大学华西医院国家药物临床试验机构临床药理研究室，四川 成都 610041；3.重庆赛诺生物药业股份有限公司，重庆 401554)

建立HPLC-MS/MS法测定人血浆中奥美拉唑（OPZ)及代谢物奥美拉唑砜（S-OPZ)、5-羟基奥美拉唑（HOPZ)的浓度，以用于奥美拉唑的药代动力学研究。采用Phenomenex Gemini C18（50mm×3.0mm，5μm)色谱柱，乙腈-水（体积比40∶60)为流动相，流量0.2mL/min，以d3-奥美拉唑（d3-OPZ)作内标，血浆样本用二氯甲烷∶异丙醇（体积比97∶3)萃取，采用ESI源，正离子MRM模式检测。OPZ在0.5～600ng/mL范围内，S-OPZ和H-OPZ在0.25～300ng/mL范围内线性良好；OPZ、S-OPZ、H-OPZ及IS的保留时间分别为3.19，4.18，1.96，3.19min左右；萃取回收率在53.8%～84.6%；高浓度血浆样品稀释4倍测定不影响结果；精密度、基质效应经内标校准后均合格；稳定性各项数据均符合相关要求。该法快速、灵敏、专属性强、重现性好，适用于奥美拉唑及其代谢物的血药浓度测定。

奥美拉唑；奥美拉唑砜；5-羟基奥美拉唑；HPLC-MS/MS；血药浓度

0 引 言

奥美拉唑(omeprazole，OPZ)作为强质子泵抑制剂，用于十二指肠溃疡、胃溃疡、胃食管返流疾病（GERD)、糜烂性食管炎的维持治疗。奥美拉唑在体内经细胞色素P450氧化酶催化代谢，其主要代谢产物[1]为经CYP2C19酶羟化代谢生成的5-羟基奥美拉唑（5′-hydroxy omeprazole，H-OPZ)和经过 CYP3A4酶将S原子氧化生成的奥美拉唑砜（omeprazole sulphone，S-OPZ)。国内外已有采用HPLC和HPLCMS/MS测定血浆中奥美拉唑含量文献报道[2-6]，但同时测定 OPZ、H-OPZ、S-OPZ 的报道较少，贺敏等[7]以地西泮为内标，样品经液-液萃取建立了LC-MS/MS法测定人血浆中OPZ等含量的分析方法；刘虹等[8]采用沉淀蛋白法，加校正因子的主成分自身对照法测定奥美拉唑肠溶胶囊中有关物质的含量；周卿等[9]建立了固相萃取-高效液相色谱法测定奥美拉唑含量的分析方法。本文采用同位素内标，液-液萃取法，建立了灵敏准确同时测定血浆中OPZ、H-OPZ、S-OPZ浓度的分析方法，并已用于化学药品第3.2类新药奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂药动学研究，结果良好。

1 仪器与试药

岛津SIL-HT型高效液相色谱仪（包括系统控制器，高压梯度输液泵，全自动进样器)；美国Applied Biosystems公司API 3000三重四极杆串联质谱仪，Analyst1.4.1数据处理软件。OPZ对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号2XJ2-UXNF，纯度99.9%)；S-OPZ（加拿大tlcpharmachem公司提供，批号 O635025，纯度 98%)、H-OPZ（加拿大 tlcpharmachem公司提供，批号 H948110，纯度 98%)、d3-OPZ（IS)对照品（加拿大tlcpharmachem公司提供，批号1194-005A3，纯度99.8%)；乙腈为色谱纯，二氯甲烷、异丙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件/质谱条件

色谱柱为Phenomenex Gemini C18（50mm×3.0mm，5μm)，柱温 40℃；流动相为乙腈-水（体积比 40∶60)，流量 0.2 mL/min，进样量 5 μL，进样时间 5.5 min。采用多反应离子监测（MRM)，正离子模式扫描，ESI离子源（离子源参数：CAD 7，NEB 9，CUR 8，喷雾电压 4800V，TEM 400℃)。 OPZ、S-OPZ、H-OPZ及内标的检测离子对分别为（m/z)346.1→198.1、362.3→150.2、362.3→214.1、349.3→198.1。

2.2 内标及质控血浆样本配制

2.2.1 储备液

精密称取OPZ对照品10.01 mg（相当于OPZ 10mg)，置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得质量浓度为200μg/mL的OPZ储备液。分别精密称取S-OPZ、H-OPZ和 d3-OPZ对照品2.04mg（相当于 S-OPZ 2mg)、0.51mg（相当于 H-OPZ 0.49mg)和 1.02mg（相当于 d3-OPZ 0.998mg)，分别置于3个10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得质量浓度为200 μg/mL的S-OPZ储备液、49 μg/mL 的 H-OPZ 储备和 99.8 μg/mL 的 d3-OPZ储备液；分别分装于EP管中备用，置-80℃冰箱避光保存。

2.2.2 内标工作液

取 d3-OPZ 储备液（99.8 μg/mL)0.1 mL，加入1.9 mL甲醇，混匀即得内标中间工作液（5 μg/mL)，取0.6mL内标中间工作液，加入14.4mL 40%乙腈，混匀即得内标工作液（200ng/mL)。

2.2.3 质控血浆样本

取上述质控用储备液，用40%乙睛依次稀释得质控工作液，按空白血浆∶工作液（体积比)=19∶1配制成高（OPZ：480 ng/mL，H-OPZ：240 ng/mL，S-OPZ：240 ng/mL)，中（OPZ：48 ng/mL，H-OPZ：24 ng/mL，SOPZ：24 ng/mL)，低（OPZ：1.5ng/mL，H-OPZ：0.75ng/mL，S-OPZ：0.75ng/mL)和定量限（OPZ：0.5ng/mL，H-OPZ：0.25ng/mL，S-OPZ：0.25ng/mL)浓度的质控血浆样本。

2.3 血浆样本预处理

取待测血浆样品200μL，加50μL内标工作液（200ng/mL)，混匀后，加入2.0mL二氯甲烷-异丙醇（体积比 97∶3)，涡旋混合 5min，低温离心 5min（8℃，3000r/min)，抽弃上层水层，转移下层有机层至尖底管中，40℃水浴通空气流挥干。残渣用50μL流动相复溶，进样 5μL。

2.4 方法优化

2.4.1 流动相的选择

方法探索过程中，为使OPZ、H-OPZ、S-OPZ有合适的保留时间，同时满足基质效应相关要求，考察了流动相中不同比例乙腈-水的出峰情况，加入不同浓度氨水后药物峰形和响应值的差别，结果发现加入氨水对峰形和响应无明显影响，为操作简便，且保护离子源，最终确定试验用流动相为乙腈-水（体积比 40∶60)。

2.4.2 预处理方法的选择

本实验中OPZ、H-OPZ、S-OPZ极性中等，在方法探索初期，曾采用乙腈沉淀蛋白进样，质谱响应过低，原因可能是血浆样本处理时被稀释，内源性物质未被去除，因此样品预处理方法改为液-液萃取法。

2.4.3 萃取剂的选择

分别考察了乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯作萃取剂时，OPZ、H-OPZ、S-OPZ的萃取回收率和基质效应，结果表明：药物及内标用乙醚萃取的回收率较低；用乙酸乙酯萃取的回收率虽高，但基质效应较大，均不可使用；二氯甲烷萃取时，除H-OPZ的萃取回收率偏低外，OPZ、S-OPZ的萃取回收率均大于60%，且基质效应均合格。考虑在二氯甲烷做萃取剂的基础上加入少量极性大的溶剂以增加H-OPZ的萃取回收率，经比较筛选，采用二氯甲烷-异丙醇（体积比97∶3)作萃取剂时，OPZ、H-OPZ 和 S-OPZ 的萃取回收率和基质效应均符合相关要求（萃取回收率＞50%，基质效应≤15%)，故本实验选用二氯甲烷-异丙醇（体积比 97∶3)作萃取剂。

2.5 方法学确认及结果

2.5.1 储备液稳定性考察

分别取新配和置-80℃冰箱保存53d的OPZ储备液 120 μL，加入甲醇 880 μL，混合后进样 5 μL。两份储备液各测定3次，计算OPZ峰面积均值的变化率为-1.07%，说明OPZ储备液于-80℃冰箱保存53d稳定。

2.5.2 线性范围及定量限考察

分别取空白血浆和空白血浆加标准工作液（19∶1)配制的标准曲线血浆样本各 200 μL，依次加入 50 μL内标工作液（空白管用 50 μL流动相代替)，按2.3项下处理进样。分别记录药物、代谢物及内标色谱峰面积，以药物与内标或代谢物与内标的峰面积之比（y)对 OPZ、H-OPZ、S-OPZ 血药浓度（x)进行加权（1/c2)线性回归，标准曲线血浆样本OPZ、H-OPZ、S-OPZ血药浓度分别为 600，500，200，80，20，5，1，0.5ng/mL；300，250，100，40，10，2.5，0.5，0.25ng/mL；300，250，100，40，10，2.5，0.5，0.25 ng/mL 时 OPZ、HOPZ和S-OPZ标准曲线方程分别为：y=0.025 8x+0.0133（r=0.9982)、y=0.00782x-0.000244（r=0.9993)和y=0.015x-0.000 593（r=0.997 7)。结果显示，OPZ在0.5～600ng/mL范围标准曲线线性良好，定量限为0.5 ng/mL，信噪比大于5，RSD为10.5%；H-OPZ和S-OPZ在0.25～300ng/mL范围标准曲线线性良好，定量下限均为0.25ng/mL，信噪比大于5，RSD分别为9.5%、9.9%，见图 1。

2.5.3 专属性考察

空白血浆、空白血浆加对照品及受试者血浆样品色谱图见图2。OPZ、S-OPZ、H-OPZ和IS的保留时间分别为 3.19，4.18，1.96，3.19min。 结果显示血浆中的内源性杂质对药物、代谢物及内标处均无干扰，本方法的专属性符合方法学评价要求。

2.5.4 精密度、方法回收率、萃取回收率、基质效应考察

取用空白血浆加标准工作液（19∶1)配制的高、中、低3个浓度血浆样本，按2.3血浆样本预处理项下操作，分别于同日内连续处理5次并测定和两周内不同日重复处理3批并测定，计算日内、日间精密度和方法回收率；将预处理后进样所得药物及内标峰面积与相同浓度的对照品溶液直接进样所得峰面积相比，计算萃取回收率，结果见表1。取6个不同来源的空白血浆，每一空白血浆6份（低、高浓度各3份)，按2.3项下操作用相应的低、高浓度工作液溶解进样得到的峰面积除以工作液直接进样得到的峰面积，计算得基质效应，结果见表1。

图1 HPLC-MS/MS测定人血浆中奥美拉唑、5-羟基奥美拉唑、奥美拉唑砜浓度的标准曲线

图2 空白血浆、空白血浆加对照品、受试者血浆中OPZ、S-OPZ、H-OPZ、IS的典型色谱图

2.5.5 稀释系数考察

考虑到实际血浆样品浓度可能会超过标准曲线的上限，故进行了4倍稀释因子的考察。取空白血浆加工作液（19∶1)配制超高浓度质控血浆样品（OPZ：1 920 ng/mL，H-OPZ：960 ng/mL，S-OPZ：960 ng/mL)50μL，加空白血浆150μL稀释后按2.3项下操作并进样。将直接计算的浓度乘以4即为换算的实际浓度，其测定5次的OPZ、H-OPZ、S-OPZ平均浓度分别为 2160.824，1 037.72，969.64 ng/mL；对应 RSD 值为1.8%、4.4%、1.5%。表明样品稀释4倍后测定结果准确可靠。

表1 血浆中OPZ、H-OPZ和S-OPZ精密度、方法回收率、萃取回收率、基质效应结果

表2 受试者口服试验制剂和参比制剂后奥美拉唑的药动学参数

图3 受试者口服试验制剂（奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂)和参比制剂（洛赛克)后血药浓度-时间曲线

2.5.6 样品稳定性考察

取用空白血浆加标准工作液（19∶1)配制的低、中、高3个浓度的血浆样品，分别考察了在室温（23℃)下放置 0，3，6 h，在低温（4℃)下光照放置 0，3，6 h，在-80℃冻存 0，14，28d，-80℃条件下反复冻融 2次（每次冻融时间超过12h)的稳定性；以及考察按2.3血浆样本预处理萃取后的样本于4℃冰箱放置0，10，20h，萃取物溶解后在进样室（8℃)放置 0，10，20 h，样品处理后立即进样与重复进样1，2次的稳定性，结果表明OPZ、H-OPZ、和S-OPZ的浓度均保持稳定，未出现明显变化，各浓度组测定结果的RSD均＜15%。

3 应 用

OPZ和内标d3-OPZ在光照条件下均不稳定，实验均应低温避光保存。为了给工作液及生物样品的储存条件、样品采集及测定过程的环境控制提供科学依据，对药物及内标的光照稳定性进行了考察。结果显示药物及内标的工作液在低温（4℃)下光照3h和6h均稳定。但为了保证测定结果准确性，在工作液贮存及样品测定过程中仍进行了避光处理。本文建立的方法已用于12例健康受试者在6个周期里分别餐后单次、空腹单次和多次（每天1次，连续7d)，口服奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂与肠溶片（洛赛克)20mg的样品测定，均值药动学参数结果见表2，空腹多次给药的均值药时曲线见图3（多次给药谷浓度均低于检测限，未在图中体现出来)，试验制剂与参比制剂空腹多次给药均无显著差异，其中S-OPZ的Cmax结果一致，而OPZ、H-OPZ的Cmax有差异，可能与自身代谢差异有关。奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂的Tmax较快，空腹单次给药时Cmax较高。

4 结束语

本研究采用同位素标记药物为内标，建立了HPLC-MS/MS联用技术，液一液萃取法同时测定人血浆中OPZ及其代谢物S-OPZ、H-OPZ的血药浓度，并完成了方法学验证。该方法具有良好和广泛的线性，运行时间短，定量限低，已成功应用于健康人体中奥美拉唑碳酸氢钠干混悬剂与肠溶片的药代动力学对比研究。

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Research on simultaneous quantitative determination method of omeprazole and metabolites in human plasma by HPLC-MS/MS

WANG Man1，2， WANG Hongqian2， QIN Yongping2， MEI Yajun1，2， NAN Feng2， XIANG Jin2， YU Qin2，LIANG Maozhi2， ZHANG Mei1， LUO Mingjun3
（1.The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine,Key Laboratory of Systematic Research,Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province,Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST，School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；2.GCP Center/Institute of Drug Clinical Trials，West China Hospital,Sichuan University，Chengdu 610041，China；3.Chongqing Sainuo Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chongqing 401554，China)

To develop an accurate and sensitive HPLC-MS/MS method forsimultaneous determination of omeprazole （OPZ)and its active metabolites omeprazole sulfone （S-OPZ)， 5-hydroxy omeprazole（H-OPZ)in human plasma to perform OPZ human pharmacokinetic studies.The extractives were separated on a Phenomenex Gemini C18 （50mm×3.0mm，5μm)column，and the mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile:water （40∶60， V/V)was delivered at a flow rate of 0.2 mL/min.D3-omeprazole was used as the internal standard.Human plasma samples were extracted with dichloromethane:isopropanol （97∶3，V/V).An electrospray ionization（ESI)source was applied and operated in the positive multiple reaction monitoring （MRM)mode.In the plasma samples， the calibration curve for OPZ and H-OPZ、S-OPZ was in the range of 0.5-600 ng/mL and 0.25-300 ng/mL.The retention time of omeprazole，omeprazole sulfone， 5-hydroxy omeprazole and IS were 3.19， 4.18， 1.96 and 3.19 min， respectively；Pretreatment recovery was 53.8%-84.6%;accuracy，precision and matrixes effect after internal standard calibration are comply with relevant requirements.The plasma samples dilute 4 times shall not affect the results.Data about all stability study fitted the request.The method is simple， rapid， sensitive and accurate for the determination of omeprazole and metabolites in human plasma and to be suitable for the pharmacokinetic study.

omeprazole； omeprazole sulfone； 5-hydroxy omeprazole； HPLC-MS/MS； plasma concentration

A

1674-5124（2017）10-0053-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.10.011

2017-01-16；

2017-03-31

王 曼（1993-)，女，四川南充市人，硕士研究生，专业方向为药物分析。

张 梅（1963-)，女，四川成都市人，教授，博导，主要从事中药及复方物质基础及质量标准化研究。

秦永平（1963-)，男，四川长宁县人，研究员，主要从事体内药物分析。

（编辑：莫婕）