结肠癌组织中Beclin1、p62的表达及与临床病理特征的关系

赖人旭 麦 蕾 高敏照 任江南 苟新敏 郭惠学

(中山大学附属第五医院消化内科，广东 珠海 519000)

1 中山大学附属第五医院病理科

·肿瘤·

结肠癌组织中Beclin1、p62的表达及与临床病理特征的关系

赖人旭 麦 蕾 高敏照 任江南 苟新敏1郭惠学

(中山大学附属第五医院消化内科，广东 珠海 519000)

目的探讨结肠癌患者组织中Beclin1、p62的表达水平及其与临床病理特征的关系。方法选取2013年1月至2015年12月中山大学附属第五医院病理科保存的78例手术切除结肠癌组织标本，并以癌旁正常黏膜组织(距离病灶组织>5 cm)标本作为对照，采用免疫组织化学法检测两组组织标本中Beclin1、p62的表达水平，分析其与临床病理特征的关系。结果结肠癌组织中Beclin1阳性表达率低于癌旁正常黏膜组织，p62阳性表达率高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)。肿瘤直径≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、肠壁浸润深度T3～T4、有远处淋巴结转移结肠癌组织中Beclin1阳性表达率更低，p62阳性表达率更高，差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman秩相关分析显示结肠癌组织中Beclin1与p62呈负相关关系(r=-0.571，P=0.012)。结论Beclin1在结肠癌组织中呈低表达水平，p62呈高表达水平，可能参与了结肠癌的发生、发展过程，联合检测可作为早期辅助诊断结肠癌及评估预后的重要指标。

结肠癌；Beclin1；p62

大多结肠癌患者在确诊时已接近中晚期，手术切除联合术后放、化疗是目前临床治疗结肠癌的常见手段。但患者预后较差，术后易发生淋巴结转移，5年生存率较低〔1〕。研究表明〔2〕，细胞自噬在恶性肿瘤的发生、发展过程中有重要作用。Beclin1是位于人17号染色体上的与自噬有关的基因，介导了肿瘤细胞的自噬、凋亡、分化过程。研究显示Beclin1可评估局部晚期结肠癌的预后〔3〕。p62是在胞质中合成，定位于细胞核中的磷酸化蛋白，研究发现p62表达增强与自噬抑制有关，其作为自噬标志物参与了自噬降解和自噬抑制过程〔4〕。本研究旨在探讨Belcin1、p62在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2013年1月至2015年12月中山大学附属第五医院病理科保存的78例手术切除的结肠癌组织标本，纳入标准：①组织标本经活检证实为结肠癌；②术前未经任何放、化疗治疗。排除标准：①心脏功能不全者；②肝肾功能障碍者；③合并其他恶性肿瘤；④合并其他可能影响本研究结果的疾病。其中男45例，女33例；年龄52～77〔平均(63.5±4.9)〕岁；肿瘤直径：<5 cm 38例，≥5 cm者40例；组织学分型：腺癌45例，黏液腺癌33例；分化程度：低分化29例，中高分化49例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期35例；肠壁浸润深度：T1～T2 37例，T3～T4 41例；有远处淋巴结转移36例，无远处淋巴结转移42例。并以癌旁正常黏膜组织(距离恶性肿瘤位置>5 cm)标本作为对照。所有组织标本均采用浓度为4%的多聚甲醛固定保存。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器 美国AB-CAM公司提供的一抗Beclin1兔多抗、p62鼠单抗，稀释为1∶100。链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(Ultra Sensitive TMSP)超敏试剂盆、柠檬酸组织抗原修复液和DAB显色试剂盒均购于福州迈新公司。德国LEICA公司提供的HI-1220型烘片机，RM-2245型组织切片，HI-1210型展片台。

1.2.2免疫组化染色 采用免疫组化SP法对结肠癌组织、癌旁正常黏膜组织中的Beclin1、p62表达水平进行检测：分别取各自经浓度4%的多聚甲醛固定3 d的组织标本，采用磷酸缓冲液(含20%～30%蔗糖)梯度脱水后将其置于-20℃的冰冻切片机上连续切片，并进行免疫组化染色，再以二甲苯进行脱蜡处理，并酒精梯度脱水，在3%的过氧化氢，温度为27℃的环境下孵育10 min，将内源性过氧化物酶灭活，滴加一抗过夜处理，在滴加经生物素标记的二抗后于27℃环境下孵育1 h，最后滴加经辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素工作液，再以二氨基联苯胺(DAB)显色后以苏木素复染，封片后在显微镜下观察染色结果。

1.3结果判定 Beclin1阳性判断标准：Beclin1主要在细胞质中呈棕黄色颗粒，阴性则为淡蓝色样的核样结果；p62阳性判断标准：p62在细胞质中呈棕黄色颗粒。在每个高倍视野(×400)下读取Beclin1、p62阳性染色细胞的数量，连续读5个高倍视野，并取平均值；染色细胞强度评分：0分为无染色，1分为淡黄色颗粒，2分为黄色颗粒，3分为棕黄色颗粒；染色细胞比例评分：阳性染色细胞数<25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，≥76%为3分；染色细胞强度评分与染色细胞比例评分相加评价最终结果：阴性(-)计0分，弱阳性(+)计1～2分，中强阳性()计3～4分，强阳性()计5～6分〔5〕。阳性率=(+)+()+()/总例数×100%。

1.4统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t、χ2检验、Spearman秩相关分析。

2 结 果

2.1结肠癌组织和癌旁正常黏膜组织中Beclin1、p62表达水平比较 结肠癌组织中Beclin1、p62阳性表达率分别为26.92%(-57例，+11例，7例，3例)、62.82%(-29例，+29例，13例，7例)，癌旁正常黏膜组织中分别为71.79%(-22例，+29例，15例，12例)、21.79%(-61例，+10例，5例，2例)，结肠癌组织中Beclin1阳性表达率低于癌旁正常黏膜组织，p62阳性表达率高于癌旁正常黏膜组织(χ2=31.415,26.893；均P=0.000)。

2.2结肠癌组织中Beclin1、p62阳性表达与临床病理特征的关系 肿瘤直径≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、肠壁浸润深度T3～T4、有远处淋巴结转移结肠癌组织中Beclin1阳性表达率低于肿瘤直径<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、肠壁浸润深度T1～T2、无远处淋巴结转移结肠癌组织，肿瘤直径≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、肠壁浸润深度T3～T4、有远处淋巴结转移结肠癌组织中p62阳性表达率高于肿瘤直径<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、肠壁浸润深度T1～T2、无远处淋巴结转移结肠癌组织(P<0.05)，结肠癌组织中Beclin1、p62阳性表达率与年龄、组织学分型无关(P>0.05)。见表1。

2.3结肠癌组织中Beclin1与p62相关性分析 结肠癌组织中Beclin1与p62呈负相关关系(r=-0.571，P=0.012)；其中Beclin1-,且p62-23例，p62+34例；Beclin 1+,且p62-6例，p62+15例。

表1 结肠癌组织中Beclin1、p62阳性表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨 论

结肠癌主要发生于直肠及直肠与乙状结肠交界处，多发于男性。结肠癌早期主要行手术切除，但术后患者易复发和发生周围淋巴结转移，而病理分期晚、分化程度较低、淋巴结转移等临床病理特征是影响预后的主要因素〔6〕。

自噬即为自体吞噬，是在自噬相关基因的调控下，细胞利用溶酶体对自身衰老的线粒体、内质网及异常蛋白等“异常结构”消化降解的过程。自噬可预防病原微生物的侵入感染、肿瘤、神经退行性病变等，是细胞适应内外环境所需要的基本调节方式〔7〕。Utaipan等〔8〕研究表明，肿瘤组织中自噬作用明显低于正常组织；Sun等〔9〕实验表明，致癌物质对鼠胰腺细胞诱导后，癌症前期的腺瘤、结节自噬能力增加，但形成癌细胞以后自噬能力降低。上述结果表明，自噬与恶性肿瘤的发生、发展过程密切相关。Beclin1蛋白可与ClassⅢPI3K结合，以复合物的形式介导自噬体的形成，是自噬的整形调节基因。研究表明〔10〕，结直肠癌组织、胃癌组织中Beclin1 mRNA表达水平较癌旁组织显著下降，同时Beclin1蛋白水平也明显降低。P62蛋白由N端Phox和Beml结构域、C端的泛素相关结构域及中间段的锌指结构域3个结构组成，它能够与泛素化蛋白结合，并通过与LC3蛋白结合以复合物的形式促进蛋白转入自噬溶酶体内发生降解，自噬发生表明蛋白不断降解，p62逐渐降低，反之，自噬发生缺陷时，p62聚集，表达水平明显升高，因此，p62可作为自噬活性的重要标志蛋白〔11〕。

本研究结果提示Beclin1在结肠癌组织中表达水平降低，p62在结肠癌组织中表达水平升高，可能参与了结肠癌的发病过程，两种指标可作为临床早期辅助诊断结肠癌的重要指标。赵坚培等〔10〕研究结果显示Beclin1 mRNA在结肠癌组织中的表达水平低于癌旁在组织，并证实自噬活性在结肠癌发病过程中明显降低。Park等〔12〕发现结肠癌组织中p62明显聚集，降解受阻。肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度及淋巴结转移等临床病理特征与患者病情进展密切相关，同时也是评价患者预后的重要参考指标，肿瘤体积越大、分化越低、TNM分期越晚、浸润深度越深及有远处淋巴结周围转移的患者，病情越严重，预后越差。本研究结果提示Beclin1、p62可能参与了结肠癌的发生、发展过程，可作为早期评估患者病情的重要指标。进一步采用Spearman秩相关分析，结肠癌组织中Beclin1与p62呈负相关性，可能与Beclin1水平降低引起自噬活性降低，从而导致自噬底物p62的大量聚集，进而通过介导NF-κB信号途径而致细胞发生癌变有关。提示联合检测Beclin1和p62有助于早期评估患者病情，进而评估患者预后。

1Kim K,Kim MJ,Kim KH,etal.C1QBP is upregulated in colon cancer and binds to apolipoprotein A-I〔J〕.Exp Ther Med,2017;13(5):2493-500.

2郭亚焕,陆建荣,廖子君,等.自噬相关蛋白 Beclin1和 LC3在结肠癌组织中的表达及临床意义〔J〕.疑难病杂志,2015;14(10):1050-2.

3Yang Z,Ghoorun RA,Fan X,etal.High expression of Beclin-1 predicts favorable prognosis for patients with colorectal cancer〔J〕.Clin Res Hepatol Gastroenterol,2015;39(1):98-106.

4Petherick KJ,Williams AC,Lane JD,etal.Autolysosomal beta-catenin degradation regulates Wnt-antophagy-p62 crosstalk〔J〕.EMBO J,2013;32(13):1903-16.

5任宇鹏,宋 纯,张 昊,等.结肠癌组织中 Beclin1及 Bcl-2表达变化及意义〔J〕.山东医药,2015；55(8):34-6.

6孙小莉,曹晓侠,丁晓明,等.宝鸡地区80例结肠癌患者发病危险因素研究〔J〕.现代生物医学进展,2016；16(23):4505-7,4519.

7Wang L,Zhu YR,Wang S,etal.Autophagy inhibition sensitizes WYE-354-induced anti-colon cancer activity in vitro and in vivo〔J〕.Tumour Biol,2016;37(9):11743-52.

8Utaipan T,Athipornchai A,Suksamrarn A,etal.Isomahanine induces endoplasmic reticulum stress and simultaneously triggers p38 MAPK-mediated apoptosis and autophagy in multidrug-resistant human oral squamous cell carcinoma cells〔J〕.Oncol Rep,2017;37(2):1243-52.

9Sun Q,Nie S,Wang L,etal.Factors that affect pancreatic islet cell autophagy in adult rats:evaluation of a calorie-restricted diet and a high-fat diet〔J〕.PLoS One,2016;11(3):e0151104.

10赵坚培,戴晓宇,谢阳阳,等.Beclin1和p62在结肠癌组织中的表达及临床意义〔J〕.中华全科医学,2017;15(5):773-5,826.

11Schläfli AM,Adams O,Galván JA,etal.Prognostic value of the autophagy markers LC3 and p62/SQSTM1 in early-stage non-small cell lung cancer〔J〕.Oncotarget,2016;7(26):39544-55.

12Park JM,Huang S,Wu TT,etal.Prognostic impact of Beclin 1,p62/sequestosome 1 and LC3 protein expression in coloncarcinomas from patients receiving 5-fluorouracil as adjuvant chemotherapy〔J〕.Cancer Biol Ther,2013;14(2):100-7.

赖人旭(1967-)，男，博士，副主任医师，主要从事消化肿瘤的诊断和治疗研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5059-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.047

〔2017-03-21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)