纳米活性炭联合吲哚菁绿定位前哨淋巴结的效果

林晓萌 陈鹊汀 韩倩倩 张 英 丁琪琼 张 刚 郝 鑫 李 中

(河北大学附属医院乳腺外科，河北 保定 071000)

1 北京协和医院临床与药理中心 2 河北大学附属医院胃肠外科

3 河北大学附属医院 河北省肿瘤放化疗机制与规程研究重点实验室

纳米活性炭联合吲哚菁绿定位前哨淋巴结的效果

林晓萌 陈鹊汀 韩倩倩 张 英 丁琪琼1张 刚2郝 鑫3李 中

(河北大学附属医院乳腺外科，河北 保定 071000)

目的探讨纳米活性炭联合吲哚菁绿定位前哨淋巴结的效果。方法示踪效果实验：动物分为ICG组、ICG+ACNP组。ICG组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG与ACNP的混悬液10 μl。注射后5、15、30、60 min分别观察腘窝淋巴结的显影成像情况并检测荧光强度。肝肾毒性观察实验：小鼠分为ICG组、 ICG+ACNP组、正常对照组(右后肢足蹼内注射等量生理盐水)，饲养2 w后，观察血常规〔白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)〕、肝功能〔谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)〕、肾功能〔尿素(Urea)、肌酐(Crea)〕等指标的变化。结果ICG溶液的荧光强度与ICG+ACNP混悬液的发光强度比较无显著性差异；注射后5、15、30 min，两组无显著性差异；60 min的时间点，ICG组的荧光剂发生转移，荧光强度减弱，与ICG+ACNP组比较有明显差异。两组与正常对照组比较，血常规、肝功能、肾功能等指标无显著差异。结论纳米碳联合吲哚菁绿定位前哨淋巴结不容易发生次级引流，安全，可行性高。

纳米活性炭；吲哚菁绿；前哨淋巴结

乳腺癌的治疗方案目前有局部治疗和全身治疗两种，但无论哪种方法，乳腺癌的诊断及分期都非常重要。在手术治疗方面，腘窝淋巴结清扫是治疗中的重要组成，对其预后有十分重要的影响〔1，2〕。腘窝在解剖结构上不仅有着丰富的血管、神经，也有大量的淋巴组织，淋巴清扫过程出现任何误差都可能对预后造成影响。目前，临床上对乳腺癌前哨淋巴结进行示踪定位活检的方法主要有染料法、核素法以及综合法〔3，4〕，这三种方法各有其利弊。近年提出的荧光法是前哨淋巴结示踪的新方法，具有更高的检出率，其中吲哚菁绿(ICG)已经应用于临床，但由于ICG量子域较低、粒径太小，导致其荧光信号持续时间不长，且容易通过淋巴结进入血液循环而代谢。在染料法中，纳米活性炭(ACNP)是一种能长时间停留在淋巴结且具有趋向性的示踪染料。本研究探讨ACNP联合吲哚菁绿ICG定位前哨淋巴结的效果及毒副作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF 级BALB/C小鼠，雄性，2月龄，体重18～22 g，共64只，购自河北省实验动物中心，许可证号 SYXK(冀)2012-0022。BALB/C小鼠饲养于实验动物中心SPF实验室，室内温度20℃～26℃、相对湿度45%～70%，昼夜各12 h。动物自由摄食饮水，其余饲养条件均符合中华人民共和国国家标准GB14925-2010中的规定。所有动物试验过程均通过动物保护委员会伦理学审查。

1.2试剂与仪器 吲哚菁绿(ICG)，丹东医创药业有限责任公 司；纳米活性炭(40 nm粒径)，北京德科岛金科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)德国BASF公司；活体成像系统IVIS Lumina Ⅱ，美国Caliper Life Sciences公司；MB2140-IC微量分析天平，德国Sigma-Aldrich公司。

1.3实验前淋巴结的确认 参考文献方法对小鼠淋巴结在解剖学上的命名定位标准〔5〕，采用联合法对10只小鼠的淋巴结进行定位，解剖腘窝及后续引流淋巴结。采用染料法辅助，辨认出腘淋巴结、髂淋巴结和肾旁淋巴结。并根据本实验目的，区别前哨淋巴结以腘窝淋巴结作为指示，次级淋巴结以髂淋巴结作为指示，第3级淋巴结以肾旁淋巴结为指示。

1.4示踪效果检测 将24只BALB/C小鼠随机分为ICG组、ICG+ACNP组，每组12只。腹腔注射3%戊巴比妥进行麻醉，以8%硫化钠脱去右后肢及腹部被毛。ICG组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG与ACNP的混悬液10 μl，ICG与ACNP的比例为1∶4。所有动物均在注射后5、15、30、60 min，取仰卧位于活体成像仪中分别观察腘窝淋巴结的显影成像情况。采用Living Image 3.1软件检测荧光强度，曝光时间为60 s。

1.5肝肾毒性观察 取未经处理的小鼠分为ICG组，ICG+ACNP组，正常对照组，每组10只。ICG组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP组于右后肢足蹼内注射浓度为20 μg/ml的ICG与ACNP的混悬液10 μl，ICG与ACNP的比例为1∶4。正常对照组于右后肢足蹼注射等量生理盐水，同样饲养2 w。观察血常规、肝功能、肾功能指标的变化。

2 结 果

2.1ICG与ICG+ACNP的荧光强度比较 ICG组荧光强度〔(7.873±0.102)×109〕与ICG+ACNP组发光强度〔(7.982±0.914)×109〕比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2两组小鼠不同时间荧光强度比较 在5、15、30 min时间点，两组荧光强度无显著性差异(P>0.05)，60 min的时间点，ICG组的荧光强度减弱，比ICG+ACNP组明显降低(P<0.05)，见表1。

2.3两组小鼠体内不同时间荧光成像比较 在60 min时，两组小鼠右侧髂内侧淋巴结信号出现差异，ICG组出现ICG向第2级淋巴结流动的情况。见图1。

2.4ICG与ICG+ACNP对血常规及肝肾功能的影响 两组白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)，与正常对照组比较无明显差异；两组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、尿素(Urea)、肌酐(Crea)与正常对照组比较也无明显差异。见表2。

表1 两组不同时间荧光强度比较

与ICG组比较：1)P<0.05

图1 ICG与ICG+ACNP在小鼠体内不同时间荧光成像比较

组别WBC(×109/L)RBC(×1012/L)PLT(×109/L)ALT(U/L)TBIL(μmol/L)Urea(mmol/L)Crea(pmol/L)TCG组334±021473±02363221±22173185±3221200±242564±1336703±624TCG+ACNP组328±020412±01663033±15673143±4011189±179601±1026659±566正常对照组320±013478±01462510±19813076±4481223±231547±0876823±754

3 讨 论

ICG已经获得FDA用于临床试验的批准，目前在临床上多用于检测心血管系统及肝功能，并作为检测后葡萄膜炎、视网膜炎等的造影剂。目前的文献已有报道将ICG用于、乳腺癌〔6〕、皮肤癌〔7，8〕、胃肠癌〔9～11〕及黑色素瘤〔12〕的前哨淋巴结活检(SLNB)示踪定位活检的研究及临床应用中，并取得良好的效果。前哨淋巴结是肿瘤淋巴引流的第一站淋巴结，对于肿瘤转移的研究尤为重要，其输入管直接连接着肿瘤原发部位。腘窝淋巴结解剖结构复杂，有着丰富的神经、血管以及大量的淋巴管连接着淋巴结或原发肿瘤部位，如定位不清，在进行淋巴结清扫时容易对周围神经血管造成损伤从而增加并发症的发生。荧光法虽然是近年来新兴的方法，但因其出色的检出率以及对机体的低损害性受到关注。荧光材料进入乳腺癌原发部位及其周围组织后，被吸收进入淋巴系统并停留其中，通过仪器可见荧光显示成像，从而定位前哨淋巴结，为乳腺癌外科手术中进行淋巴结清扫提供帮助。

ICG初期由于突出的检出率而受到青睐，但由于ICG量子域较低且粒径小导致其在淋巴结停留时间缩短然后进入血液循环代谢，减弱了其荧光信号而影响到检出率。在染料示踪材料中，ACNP是一种能长时间停留在淋巴结且具有趋向性的示踪染料，有临床资料显示对92名早期乳腺癌患者以ACNP混悬液示踪前哨淋巴结，具有98%的检出率、96%的准确率以及较低的假阴性率〔13〕；且其具有多孔蜂窝样结构，能较好地吸附药物及在淋巴结中停留。本实验结果显示，ACNP对ICG的荧光效果无明显影响，二者结合后能延长ICG在淋巴结的停留时间并能较好地保持荧光强度，优于ICG单用的效果；而ACNP联合定位前哨淋巴结不容易发生次级引流，安全可行性高。

1Ferlay J,Shin HR,Bray F,etal.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008〔J〕.Int J Cancer,2010;12(12):2893-917.

2Lyman GH,Temin S,Edge SB,etal.Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer:American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update〔J〕.J Clin Oncol,2014;32(13):1365-83.

3Ahmed M,Purushotham AD,Douek M.Novel techniques for sentinel lymph node biopsy in breast cancer:a systematic review〔J〕.Lancet Oncol,2014;15(8):351-62.

4Johnson S,Arora S,Babu E.Injecting patent blue dye V for sentinel lymph node biopsy without shin staining〔J〕.Ann R Coll Surg Engl,2012;94(4):277-8.

5丛斌斌,孙 晓,宋现让,等.新型前哨淋巴结示踪剂的制备及动物实验研究〔J〕.中国癌症杂志,2016;26(3):245-50.

6Troyan SL,Kianzad V,Gibbs SL,etal.The FLARE intraoperative near infrared fluorescence imageing system:a first in human clinical trial in breast cancer sentinel lymph node mapping〔J〕.Ann Surg Oncol,2009;16(10):2943-52.

7Jain V,Phillips BT,Conkling N,etal.Sentinel lymph node detection using laser-assisted indocyanine green dye lymphangiography in patients with melanoma〔J〕.Int J Surg Oncol,2013;2013:904214.

8Cloyd JM,Wapnir IL,Read BM,etal.Indocyanine green and fluorescence lymph angiography for sentinel lymph node identification in cutaneous melanoma〔J〕.J Surg Oncol,2014;110(7):888-92.

9Tajima Y,Murakami M,Yamazaki K,etal.Sentinel node mapping guided by indocyanine green fluorescence imaging during laparoscopic surgery in gastric cancer〔J〕.Ann Surg Oncol,2010;17(7):1878-93.

10Miyashiro I,Hiratsuka M,Kishi K,etal.Intraoperative diagnosis using sentinel node biopsy with indocyanine green dye in gastric cancer surgery:an institutional trial by experienced surgeons〔J〕.Ann Surg Oncol,2013;20(2):542-6.

11Noura S,Ohue M,Seki Y,etal.Feasibility of a lateral region sentinel node biopsy of lower rectal cancer guided by indocyanine green using a near infrared camera system〔J〕.Ann Surg Oncol,2010;17(1):144-51.

12van der Vorst JR,Schaafsma BE,Verbeek FP,etal.Dose optimization for near-infrared fluorescence sentinel lymph node mapping in patients with melanoma〔J〕.Br J Dermatol,2013;168(1):93-8.

13宋大公,丁红华.纳米碳混息液示踪早期乳腺癌前哨淋巴结92例〔J〕.实用医技杂志,2013;(5):532.

河北省卫计委2016年度医学科学研究重点课题(20160045)

李 中(1966-)，男，硕士，主任医师，主要从事乳腺分子生物学及临床研究。

林晓萌(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事乳腺保乳及整形技术方面研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-4990-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.015

〔2016-11-19修回〕

(编辑 徐 杰)