七氟烷在大鼠心脏再灌注心律失常中的作用及对心肌细胞电生理的影响

查木哈格 于建设

(内蒙古医科大学附属医院麻醉科，内蒙古 呼和浩特 010050)

七氟烷在大鼠心脏再灌注心律失常中的作用及对心肌细胞电生理的影响

查木哈格 于建设

(内蒙古医科大学附属医院麻醉科，内蒙古 呼和浩特 010050)

目的探讨七氟烷在大鼠心脏再灌注心律失常中的作用及对心肌细胞电生理的影响。方法取SD大鼠40只，采用Langendoeff灌注建立心脏再灌注心律失常模型，采用重碳酸盐缓冲液(KH)进行15 min处理后分为空白对照组、缺血再灌注组、七氟烷预处理组和七氟烷后处理组，每组10只，采用标准的全细胞膜片钳技术进行电生理实验。结果缺血再灌注组再灌注15、30 min左心室舒张压(LVDP)及心率水平低于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组及缺血再灌注组再灌注15、30 min左室舒张末压(LVEDP)水平高于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组处理后肌钙蛋白Ⅰ水平低于缺血再灌注组，高于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组和缺血再灌注组均可见明显的心肌梗死；七氟烷后处理组处理后细胞内钙离子和活性氧水平低于七氟烷预处理组和缺血再灌注组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组、缺血再灌注组心肌细胞动作电位参数低于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组电位参数高于缺血再灌注组(P<0.05)。结论心脏再灌注心律失常大鼠采用七氟烷处理后能改善其血流动力学，减少梗死面积，减少对心肌细胞电生理的影响。

心肌缺血；再灌注心律失常；七氟烷；血流动力学

有研究提出机体短暂心肌缺血能对心肌缺血产生一定的保护作用，成为缺血预处理〔1〕。随着医疗技术的不断发展，相关学者提出〔2〕，机体产生时间缺血后，在复灌时进行反复短暂缺血处理，能缓解患者症状，降低再灌注损伤发生率。研究显示〔3〕，麻醉药物预处理或麻醉药后处理，均能进一步激发内源性保护机制，从而能减轻心肌缺血再灌注损伤(MIRI)程度。此外，通过麻醉药物实施预处理和后处理较机械性处理安全性较高，可控性也较强，临床应用的可行性较大，能作为缺血性心脏病患者心脏或非心脏手术的一种保护性干预方法。目前，临床上常用的麻醉药物包括异氟烷、七氟烷、恩氟烷等，但挥发性麻醉药物在缺血中的处理普遍认为：被动保护作用机制可能与机体内细胞内钙超载、降低氧自由基水平等有关，而主动保护则与机体相关酶通路有关，同时调控相关酶的活性从而控制蛋白的翻译、转录，产生心肌保护作用，该结论尚未得到进一步证实〔4〕。本文拟探讨七氟烷在大鼠心脏再灌注心律失常中的作用及对心肌细胞电生理的影响。

1 材料与方法

1.1动物与分组 于2015年1月至2016年7月取SD大鼠40只，SPF级，雌雄随机，体重250～300 g，平均(278.1±5.3)g，采用重碳酸盐缓冲液(KH液)进行15 min处理后分为空白对照组、缺血再灌注组、七氟烷预处理组和七氟烷后处理组，每组10只。均由内蒙古医科大学医学动物实验中心提供。实验过程中对大鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》〔5〕相关规则。试验均通过医院动物委员会批准同意。

1.2仪器及试剂 主要仪器和试剂主要有七氟烷(Sevoflurane)(Mamishi Pharmaceutical 公司，日本)，Ⅱ型胶原酶(Worthington公司)，Fura-2AM和DCFH-DA荧光探针(南通碧云天公司)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司)，血流动力学监测设备(AD Instruments 公司，Colorado Springs，美国)，荧光分光光度计(型号：F320，港东公司，天津)，微电极控制仪(型号SUTTER P-97 (美国Sutter公司))，微电极抛光仪(型号 MF-830，日本 NARISHIGE 公司)。

1.3方法

1.3.1模型构建 向入选大鼠其腹腔内注射1 000 U/kg肝素完成肝素化处理，10 min后向腹腔内注射1.5 g/kg乌拉坦进行麻醉，待麻醉生效后将其固定在实验室操作台上。找到解剖标志剑突后，沿着胸骨下缘剪开胸腔，然后轻轻剪开心包，游离心脏周围的组织和脂肪，确定心底部的主动脉，了解心脏周围的结构、联系，沿着心底部快速横断主动脉，取出心脏并放入4℃无钙式液中，去除心腔中的残留血液和组织。在剪取心脏的同时，预留长为2 mm的主动脉，便于悬挂在灌注设备上。然后将心脏在取出后30 s内悬挂在Langendoeff灌注装置上，结扎并固定主动脉，设置相关参数，控制流速为10 ml/min向主动脉泵入浓度为95.0%、5%CO2饱和的KH液，整个灌注装置提前采用水浴箱进行处理，控制心脏灌注液温度为37℃，从而完成大鼠模型建立〔6〕。

1.3.2处理方法 四组大鼠模型建立完毕后，根据预先分组进行相应的处理。空白对照组在建模后给予普通KH液进行75 min灌注；缺血再灌注组建模后在平衡器进行20 min灌注，随后停止灌注25 min，再次进行30 min灌注；七氟烷预处理组建模后平衡器给予浓度为3%七氟烷饱和的KH液进行15 min灌注，然后采用KH液进行5 min洗脱，然后停止灌注25 min，然后采用普通KH液进行30 min复灌；七氟烷后处理组建模成功后灌注普通KH液进行20 min灌注，停止灌注25 min，复灌之初采用浓度为3%七氟烷饱和KH液进行15 min灌注，然后采用普通KH液进行15 min灌注〔7〕。

1.4观察指标 (1)血流动力学：采用Langendoeff灌注监测系统测定四组大鼠血流动力学变化情况，了解大鼠处理后血流动力学情况〔8〕。(2)肌钙蛋白 Ⅰ：四组大鼠分别在平衡期、复灌结束时采用1 ml冠脉流出液，采用180全自动化学发光免疫系统及配套试剂盒完成肌钙蛋白I的测定。(3)心肌梗死面积：采用2，3，5-氯三苯四唑染色法进一步确定四组大鼠的心肌梗死面积。在灌注结束后，采集各组大鼠心脏，沿着短轴切成厚度为1～2 mm切片，拍照后采用相关软件进行图像分析，根据梗死面积占总面积的百分数进行计算〔9〕。(4)细胞内钙离子或活性氧水平。采用荧光指示剂Fura-2 AM测定细胞内钙离子浓度。采用荧光指示剂2′7′-二氨荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)完成四组大鼠心肌细胞内活性氧水平的测定，相关操作步骤严格遵循仪器、试剂盒操作说明进行。(5)电生理实验：根据医院现有条件采用膜片钳系统，包括电极支持系统、膜片钳反馈系统、计算机设备等。控制实验室温度恒定，将整个膜片钳实验在恒温下，向灌流槽中滴加0.5 ml细胞悬液，5～10 min静置，待细胞贴壁后采用纯氧饱和的细胞外液进行5～10 min灌流，速度为1～2 ml/min。经膜片钳反馈的信号经过电极导丝传入细胞，产生电流信号经过负反馈放大器进行测定，经过数模转换后传入到计算机中，记录相关数据〔10〕。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。

2 结 果

2.1四组再灌注15、30 min血流动力学参数比较 缺血再灌注组再灌注15、30 min左心室舒张压(LVDP)及心率水平低于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组及缺血再灌注组再灌注15、30 min左室舒张末压(LVEDP)水平高于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组再灌注15、30 min LVDP、心率及LVEDP高于七氟烷预处理组及缺血再灌注组(P<0.05)。见表1。

表1 四组再灌注15、30 min血流动力学参数及处理前后肌钙蛋白Ⅰ水平比较

与空白对照组比较：1)P<0.05；与七氟烷后处理组比较：2)P<0.05；与缺血再灌注组比较：3)P<0.05；下表同

2.2四组大鼠处理前及处理后肌钙蛋白Ⅰ水平比较 四组大鼠处理前肌钙蛋白Ⅰ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组处理后低于缺血再灌注组，高于空白对照组(P<0.05)。见表1。

2.3四组心肌梗死面积比较 空白对照组未见心肌梗死，故未列入统计。七氟烷后处理组、七氟烷预处理组和缺血再灌注组均可见明显的心肌梗死，七氟烷后处理组、七氟烷预处理组梗死面积差异无统计学意义(P>0.05)，但小于缺血再灌注组(P<0.05)。见图1。

2.4四组处理前后细胞内钙离子和活性氧水平比较 两组处理前细胞内钙离子和活性氧水平差异无统计学意义(P>0.05)；七氟烷后处理组处理后细胞内钙离子和活性氧水平低于七氟烷预处理组和缺血再灌注组(P<0.05)。见表2。

图2 各组心肌梗死面积比较

组别钙离子(mmol/L)处理前处理后活性氧水平(ng/ml)处理前处理后七氟烷后处理组230±12132±11253±32157±13七氟烷预处理组229±11145±122)251±31171±162)缺血再灌注组231±13164±162)255±34189±182)

2.5四组处理后心肌细胞动作电位参数变化比较 七氟烷后处理组、七氟烷预处理组、缺血再灌注组心肌细胞动作电位参数低于空白对照组(P<0.05)；七氟烷后处理组、七氟烷预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但高于缺血再灌注组(P<0.05)。见表3。

表3 四组处理后心肌细胞动作电位参数变化比较

3 讨 论

七氟烷是临床上使用较多的麻醉药物，该药物具有诱导快、血流动力学稳定及冠脉窃血发生率低等特点，对于大鼠心脏再灌注心律失常中具有良好的保护作用，能作为手术中心肌保护的一种重要手段，从而能有效改善患者预后。七氟烷根据给药时间及心肌缺血发生先后顺序可以分为缺血前使用、缺血时使用及缺血后使用。通过七氟烷能完成心肌的保护，能降低机体内肌钙蛋白I水平，从而降低心肌梗死面积〔11〕。

七氟烷能改善机体左心室后负荷，有效抑制左心房、心脏收缩，从而能降低心室舒张功能，机体能药物依赖的降低血压水平，改善机体血流动力学水平。本实验结果提示，七氟烷能稳定机体血流动力学，改善机体症状，能直接抑制心脏L型钙通道，从而阻碍钙离子的跨膜转运，降低肌浆网对于钙离子的利用，从而抑制心肌收缩力。此外，七氟烷还能调节心肌氧化应激反应，从而能保护心肌细胞膜，保护再灌注心肌功能。本研究结果提示，七氟烷在大鼠心脏再灌注心律失常中具有良好的作用，药物能维持心肌细胞运动电位正常，避免正常心肌再灌注损伤后运动电位引起的差异，从而能降低室壁离散度，能有效预防再灌注心律失常发生率。此外，七氟烷能减少心肌细胞间的异质性，进一步预防心肌复极离散度，降低再灌注心律失常的严重程度〔12〕。

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内蒙古自治区自然基金项目(No.2016MS(LH)0820);内蒙古自治区卫生和计划委员会项目(No.201303056)

于建设(1963-)，男，主任医师，主要从事临床麻醉研究。

查木哈格(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事临床麻醉研究。

R54

A

1005-9202(2017)20-4971-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.007

〔2017-02-18修回〕

(编辑 袁左鸣)