当药醇苷对β淀粉样蛋白诱导神经细胞损伤模型GSK-3β及Akt表达的影响

赵志英 胡志强 高洋洋

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010)

当药醇苷对β淀粉样蛋白诱导神经细胞损伤模型GSK-3β及Akt表达的影响

赵志英 胡志强 高洋洋

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010)

目的研究当药醇苷对阿尔茨海默病(AD)细胞模型糖原合成酶激酶(GSK)-3β及蛋白激酶 B(Akt)表达的影响及机制。方法10 μmol/L Aβ作用于PC12细胞制作成AD细胞模型。实验分为正常对照组，模型组，当药醇苷低剂量组，当药醇苷高剂量组，LY294002组，LY294002+当药醇苷高剂量组。结果与正常对照组比较，模型组p-Akt蛋白水平明显下降(P<0.05)，而p-GSK-3β蛋白显著升高(P<0.05)。与模型组比较，当药醇苷高、低剂量组p-Akt蛋白表达水平明显升高，p-GSK-3β蛋白表达显著下降(P<0.05)；当药醇苷高、低剂量组间比较差异不显著(P>0.05)；用LY294002处理的两组p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表达水平与正常对照组无显著差异(P>0.05)，LY294002+当药醇苷高剂量组与当药醇苷高、低剂量组的p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表达水平比较有统计学差异(P<0.05)。结论当药醇苷可以拮抗Aβ导致的AD神经损伤，具有神经细胞保护作用，其作用机制可能通过激活PI3K/Akt 信号通路，提高p-Akt蛋白表达水平，抑制该通路下游靶分子 p-GSK-3β 活性而实现。

当药醇苷；阿尔茨海默病(AD)；PI3K/Akt通路；糖原合成酶激酶(GSK)-3β

糖原合成酶激酶(GSK)-3β是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路下游分子，是少见的通过磷酸化而失活的蛋白激酶之一，其磷酸化后活性明显降低。GSK-3β水平增高可以经过一系列级联反应导致β淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积和tau蛋白过度磷酸化，在阿尔茨海默病(AD)患者脑内水平明显增高〔1〕。因此，对GSK-3β的调控可能成为治疗AD的重要靶点。Xanthones(口山酮)是一类有广泛药理活性的多酚类化合物，具有神经系统兴奋、抗炎、保肝以及抗病毒等作用〔2〕。口山酮类化合物包括雏菊叶龙胆酮和当药醇苷等，当药醇苷有缓解乌头碱引发的心律失常及保护心肌细胞等作用〔3〕，而当药醇苷拮抗神经损伤的研究少见。本文探讨当药醇苷对Aβ引起神经细胞损伤的影响及部分机制。

1 材料和方法

1.1材料 PC12细胞购自上海细胞所；当药醇苷来源于包头医学院蒙药药用植物资源保护与开发利用院士工作站，纯度≥95%。Aβ，Sigma公司产品分装，羊抗鼠IgG二抗购于宝信生物科技公司。

1.2方法

1.2.1PC12细胞培养 复苏PC12细胞，DMEM培养液培养，2～3 d换液一次，待PC12细胞生长旺盛，占瓶底70%～80%时传代，取对数生长周期细胞用于实验。加入Aβ 10 μmol/L作用PC12细胞24 h后制作AD细胞模型。

1.2.2分组 将培养的PC12细胞分为六组。(A)正常对照组(正常培养的PC12细胞)；(B)神经细胞损伤模型组(在培养的PC12细胞中加入Aβ 10 μmol/L)；(C)当药醇苷低剂量组(Aβ 10 μmol/L+当药醇苷25 mmol/L)；(D)当药醇苷高剂量组(Aβ 20 μmol/L+当药醇苷50 mmol/L)；(E)LY294002组(在PC12细胞中加入Aβ 10 μmol/L+LY294002即PI3K/Akt信号通路抑制剂)；(F)LY294002+当药醇苷高剂量组(Aβ10 μmol/L+LY294002+当药醇苷50 mmol/L)。

1.2.3Western印迹检测 将各组PC12细胞分别加入裂解液提取蛋白，用Bradford法蛋白定量，蛋白质样品用SDS-PAGE凝胶电泳，转膜。三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜后加入碱性磷酸酶(AP)标记的二抗，ECL检测液显色，β-actin为内参，用凝胶图像软件系统分析。

1.3统计学方法 使用SPSS19.0软件，定量资料两样本均数间比较行t检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组 Akt与p-Akt 表达水平比较 与正常对照组〔(101.31±9.98)%〕比较，模型组p-AKT/AKT水平〔(61.29±6.58)%〕明显下降(P<0.05)；与模型组比较，25、50 μmol/L当药醇苷组p-AKT/AKT表达水平〔(99.89±10.23)%，(101.67±10.86)%〕明显升高(P<0.05)，而当药醇苷二组间比较差异不显著(P>0.05)；用LY294002处理的LY294002组和LY294002+当药醇苷高剂量组，p-AKT/AKT表达水平〔(63.36±6.81)%，(65.27±7.02)%〕与正常对照组无显著差异(P>0.05)，LY294002组与25、50 μmol/L当药醇苷组的p-Akt蛋白表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A：正常对照组；B：模型组；C：当药醇苷低剂量组；D：当药醇苷高剂量组；E：LY294002组；F：LY294002+当药醇苷高剂量组；下图同图1 Western印迹检测各组细胞Akt、p-Akt表达

2.2各组 GSK-3β 及 p-GSK-3β 蛋白表达水平比较 与正常对照组〔(63.24±6.45)%〕比较，模型组p-GSK-3β/GSK-3β〔(34.67±4.32)%〕显著降低(P<0.05)。与模型组比较，25、50 μmol/L当药醇苷组p-GSK-3β/GSK-3β表达明显升高〔(89.13±9.16)%，(92.64±9.03)%〕(P<0.05)；25、50 μmol/L当药醇苷组间比较差异不显著(P>0.05)；LY294002组和LY294002+当药醇苷高剂量组，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平〔(75.23±7.22)%，(71.46±7.17)%〕与正常对照组无显著差异(P>0.05)，LY294002+当药醇苷高剂量组与25、50 μmol/L当药醇苷组的表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 Western印迹检测各组细胞GSK-3β、p-GSK-3β表达

3 讨 论

PI3K/Akt信号通路的调控在神经元生存、代谢、增殖、分化以及最终的凋亡过程中发挥重要作用〔4〕。Akt是PI3K/Akt信号通路中位于核心环节的重要信号蛋白，PI3K 通过磷酸化Akt使其活性增强，Akt活化后引发下游信号分子GSK-3β、Bcl-2相关蛋白、caspase系列蛋白酶等磷酸化，从而起到抗神经元凋亡及促进神经元存活的作用〔5,6〕。GSK-3β 是一种通过磷酸化作用而抑制糖原合成酶的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，GSK-3β磷酸化后其生物活性即受到相应抑制。GSK-3β的过度表达及活性增高可以导致tau蛋白过度磷酸化，而tau 蛋白过度磷酸化是AD的病因之一，也是该病重要的分子生物学改变特征。GSK-3β通过调节APP的裂解导致Aβ的生成增加〔7〕，因此，通过采取相应措施抑制GSK-3β的磷酸化，可能成为AD治疗的靶点。本研究发现当药醇苷可以拮抗Aβ导致的AD神经损伤，抑制GSK-3β磷酸化，具有神经细胞保护的作用。AD发病机制尚未完全阐明，其中Aβ级联学说被广为接受，即脑内在遗传及内外环境因素发生变化刺激下生成Aβ，Aβ在脑内特定区域聚集，产生相应的神经毒性，造成神经突触损伤、神经元凋亡，最终引发认知障碍。而Aβ可能主要通过PI3K/Akt 信号通路途径引发神经元凋亡〔8〕。PI3K/Akt 通路下游分子中的GSK-3β是多种重要凋亡相关蛋白之一，GSK-3β可以促进过量Aβ生成、Tau蛋白过度磷酸化，并可以促使下游底物促凋亡蛋白caspase-9以及 caspase-3的磷酸化。磷酸化GSK-3β可以导致神经突触功能可塑性障碍下降以及神经元的凋亡〔9〕。因此抑制GSK-3β的活性可能对AD的治疗起到有益的作用，GSK-3β将成为治疗AD药物作用的强有力的靶点之一。龙胆科龙胆属(Gentiana)植物及其提取物具有抑制乙酰胆碱酯酶、保肝、抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗肿瘤等多方面的药理作用〔10,11〕。本研究结果发现，Aβ能降低PC12细胞中p-Akt蛋白表达水平，提高p-GSK-3β蛋白表达水平，当药醇苷可拮抗Aβ引起的这种效应，即下调Aβ引起的PC12细胞p-Akt蛋白表达水平和上调p-GSK-3β蛋白表达水平；若预先用PI3K/Akt信号通路处理PC12细胞，再应用当药醇苷处理细胞，则不会出现PC12细胞p-Akt蛋白表达水平和p-GSK-3β蛋白表达水平的改变，这与当药醇苷对抗PC12细胞损伤的效果是一致的，说明GSK-3β磷酸化水平下降可能是通过激活了上游的 Akt 活性，促使Akt磷酸化水平升高而引起，从而对P12细胞起到保护作用。

1Mohan ML，Jha BK，Gupta MK，etal.Phosphoinositide 3-kinase gamma inhibits cardiac GSK-3 independently of Akt〔J〕.Sci Signal，2013;6(259)：a4.

2吕丽娟，王艳芳，闫 墩，等.尖叶假龙胆中当药醇苷的制备及其抗乌头碱致小鼠心律失常作用〔J〕.中国新药与临床杂志，2015;34(8)：630-5.

3Karran E，Mercken M，De Strooper B.The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease:an appraisal for the development of therapeutics〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2011;10(9):698-712.

4代文博，曾 亮.PI3K/Akt信号通路与阿尔茨海默病关系的研究进展〔J〕.现代医药卫生，2014;30(10)：1499-501.

5Kong J,Ren G,Jia N,etal.Effects of nicorandil in neuroprotective activation of PI3K/AKT pathways in a cellular model of Alzheimer's disease〔J〕.Eur Neurol,2013;70(3/4):233-41.

6Jha SK,Jha NK,Kar R,etal.p38 MAPK and PI3K/AKT signalling cascades in Parkinson's disease〔J〕.Int J Mol Cell Med,2015;4(2):67-86.

7Benek O,Aitken L,Hroch L,etal.A direct interaction between mitochondrial proteins and amyloid-beta peptide and its significance for the progression and treatment of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Med Chem,2015;22(9):1056.

8Sancheti H,Akopian G,Yin F,etal.Age-dependent modulation of synaptic plasticity and insulin mimetic effect of lipoic acid on a mouse model of Alzheimer's disease 〔J〕.PLoS One,2013;8(7):e69830.

9Forlenza OV，e-Paula VJ，Diniz BS.Neuroprotective effects of lithium:implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders〔J〕.ACS Chem Neurosci，2014；5(6):443-50.

10吕丽娟，王艳芳，闫 暾，等.尖叶假龙胆中当药醇苷的制备及其抗乌头碱致小鼠心律失常作用〔J〕.中国新药与临床杂志，2015;34(8)：630-5.

11仓木决，黄宛雨.藏药蒂达的药理作用〔J〕.西藏科技，2017;(1)：40-1.

TheeffectofswertianolinontheexpressionsofGSK-3betaandAktinnervecellinjurymodelinducedbyAβ

ZHAOZhi-Ying,HUZhi-Qiang,GAOYang-Yang.

InnerMongoliaUniversityOfScience&Technology,BaotouMedicalCollege,Baotou014010,InnerMongolia,China

ObjectiveTo explore the effect of Swertianolin against the Aβ-inducing PC12 cells(Alzheimer's disease, AD) and evaluate the expression of glycogen synthase kinase(GSK)-3β and protein kinase B (Akt) after the treatment with Swertianolin to explore the mechanism involved in it.MethodsAD model was induced by 10 μmol/L Aβ in PC12 cells. Cells were divided into: control, Aβ-inducing (model), low, high dose of Swertianolin, LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups.ResultsCompared with control group, the p-Akt protein level was significantly decreased (P<0.05), while the p-GSK-3 protein was significantly increased(P<0.05) in model group. Compared with model group, p-Akt protein was significantly increased and p-GSK-3β protein was significantly decreased in high and low dose groups (P<0.05). There were no significant differences in p-Akt and p-GSK-3β protein between high and the low dose groups (P>0.05). There were no significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein among LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups and control group (P>0.05). There were significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein between LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin and low, high dose of Swertianolin groups.ConclusionsSwertianolin could reduce Aβ-inducing nerve injury in PC12 cell by increasing the expression of p-Akt protein and decreasing the activity of p-GSK-3βin the PI3K/Akt signaling pathway.

Swertianolin;Alzheimer's disease(AD);PI3K/Akt signaling pathway;Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3 beta)

国家自然科学基金资助项目(No.81560195)；内蒙古自然科学基金资助项目(No.2015MS0864)；包头医学院科学研究基金资助项目(No.BYJJ-YF201624)

胡志强(1975-)，男，在职硕士，副主任医师，主要从事神经损伤与保护研究。现在乌兰浩特市人民医院工作。

赵志英(1970-)，男，教授，博士，主要从事神经退行性疾病发病机制及防治研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)20-4969-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.006

〔2017-03-17修回〕

(编辑 徐 杰)