Apelin13增强大鼠吗啡镇痛效能及对p38 MAPK和ERK活化的影响

郭延洪 阿良德 王占鹏 樊海宁

(青海大学附属医院麻醉科，青海 西宁 810000)

Apelin13增强大鼠吗啡镇痛效能及对p38 MAPK和ERK活化的影响

郭延洪 阿良德 王占鹏 樊海宁

(青海大学附属医院麻醉科，青海 西宁 810000)

目的探讨鞘内注射Apelin13(APL)对大鼠吗啡镇痛效能的影响。方法选取40只雄性健康SD大鼠进行鞘内置管，并随机分为对照组、APL高剂量(APL-H)组、中剂量(APL-M)组及低剂量(APL-L)组(n=10)，APL-H、APL-M及APL-L组分别接受鞘内注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES缓冲液，对照组鞘内注射等体积的MES缓冲液，1次/d，连续5 d。各组均在鞘内给药前(d0)和给药后第6天(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg吗啡，测定各组右后爪的热刺激缩足反应潜伏期(PWTL)及甩尾潜伏期(TFL)，并计算最大可能镇痛效应百分比(MPE)。第8天行为学测试结束后处死大鼠，采用Western印迹检测脊髓腰膨大处的磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)的表达。结果各组d0时基础PWTL和TFL的差异无统计学意义(P>0.05)，且对照组和APL-L组d0、d6、d7、d8时PWTL、MPE和TFL的差异无统计学意义(P>0.05)；APL-M组和APL-H组d6～d8时的PWTL、MPE和TFL水平均高于d0，且APL-M组和APL-H组d6～d8时的PWTL、MPE和TFL水平均高于对照组(P<0.05)；APL-M组和APL-H组的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于对照组和APL-L组，且APL-H组该两种蛋白水平均低于APL-L组和APL-M组(P<0.05)。结论鞘内注射APL可抑制热痛敏并提高吗啡镇痛效能，其机制可能与抑制p38 MAPK和ERK活化有关，在恢复吗啡耐受大鼠的吗啡镇痛效果上有一定价值。

Apelin13；吗啡；镇痛效能；p38丝裂原活化蛋白激酶；细胞外调节蛋白激酶

Apelin是由人体APLN基因合成的含77个氨基酸的前蛋白原，转运至内质网后切割成为不同的信号肽〔1〕，其中Apelin-13(APL)含有13个氨基酸。Apelin受体在心血管系统中表达，其在控制水和食物摄入中发挥重要作用〔2～4〕。近期研究发现APL具有镇痛效应，且可减轻神经病理性疼痛〔5，6〕。吗啡是临床上常用的麻醉药物，长期应用吗啡可导致吗啡镇痛效应的下降，出现吗啡耐受现象〔7〕。但目前APL能否影响吗啡的镇痛效能尚未有相关报道，故本研究观察鞘内注射外源性APL对吗啡镇痛效能的影响及对脊髓腰膨大处p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)活化的作用，从而探讨APL对吗啡镇痛效能的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 APL购自美国Sigma公司，盐酸吗啡注射液购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司，兔抗磷酸化(p)-p38 MAPK抗体购自美国Abcam公司，兔抗p-ERK抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国CST公司，BCA 蛋白测定试剂盒购自美国Pierce公司，ECL化学发光试剂盒及PVDF膜购自美国Millipore公司；足底辐射热痛觉测试仪，美国IITC Life Science公司；垂直电泳仪及半干电转移仪，美国Bio-Rad 公司。

1.2动物与分组 40只雄性SD大鼠(体重为150～180 g)购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0005，实验动物使用许可证号：SYXK(青)2012-0003。适应性喂养1 w后行鞘内置管并随机分为对照组、APL高剂量(APL-H)组、中剂量(APL-M)组及低剂量(APL-L)组，每组10只。APL-L、APL-M及APL-H组分别接受鞘内注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES缓冲液，对照组鞘内注射等体积的MES缓冲液，1次/d，连续5 d。本实验所用大鼠鞘内置管及后续行为学检测期间均饲养于SPF级实验动物房，日光灯明暗交替12 h，室温22℃～25℃，湿度40%～70%。

1.3鞘内置管 经腹腔注射水合氯醛麻醉后，以L5棘突水平为切口中心行背部正中切口，逐层分离直至暴露出L5椎板，将部分棘突钳除以暴露L5～L6间隙，采用8号针头刺破椎间隙的脊髓和韧带，轻柔地插入PE-10导管，当插管深度为1.5～2.0 cm时经皮下隧道固定于颈部，采用10 μl生理盐水冲管后封管。术后将每只大鼠进行单笼饲养，于术后6 d经导管注射利多卡因，以出现双后肢麻痹为置管成功。

1.4热刺激检测缩足反应潜伏期(PWTL) 各组均在鞘内给药前(d0)和给药后第6(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg吗啡，测定各组的右后爪的PWTL：将大鼠置于玻璃板(厚度为3 mm)上至少适应30 min后采用热痛刺激仪光源，焦距通过玻璃板照射动物后肢足底掌心，以开始照射至出现后肢回缩反应的时间为PWTL。为避免损伤，每次照射时间控制在20 s以内。根据吗啡处理前及处理后30 min的PWTL数值计算最大可能镇痛效应百分比(MPE)，公式：MPE=(镇痛阈值-基础阈值)/(最长照射时间-基础阈值)。

1.5甩尾潜伏期(TFL)检测 各组均在d0和d6、d7、d8天皮下注射10 mg/kg吗啡，测定各组的TFL：将大鼠固定于鼠笼，将尾部约3 cm浸入52℃热水中，以浸入水中至甩出睡眠的时间为TFL。

1.6Western印迹检测 于第8天行为学测试结束后处死大鼠，取出脊髓腰膨大处，研磨后加入裂解液裂解，12 000 r/min离心15 min后取上清，采用BCA法检测蛋白浓度。每个样本取20 μg上样，经10% SDS-PAGE分离及半干转后，根据膜面积加入适量p-p38 MAPK和p-ERK一抗，4℃孵育过夜，次日加入二抗，经ECL化学发光法显色，采用IPP软件计算各条带的光密度，最终结果表示为目的条带与内参GAPDH的比值。

1.7统计学处理 采用SPSS20.0软件，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

2 结 果

2.1APL处理对基础PWTL的影响 对照组及APL处理组d0时PWTL水平的差异无统计学意义(P>0.05)；对照组和APL-L组各时间点PWTL水平的差异亦无统计学意义(P>0.05)；APL-M组和APL-H组d6～d8时的PWTL水平均高于d0，且APL-M组和APL-H组d6～d8时的PWTL水平均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 APL处理前后的基础PWTL比较

与d0比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05；下表同

2.2APL处理对MPE的影响 对照组及APL处理组d0时MPE水平的差异无统计学意义(P>0.05)；对照组和APL-L组各时间点MPE水平的差异亦无统计学意义(P>0.05)；APL-M组和APL-H组d6～d8时的MPE水平均高于d0，且APL-M组和APL-H组d6～d8时的MPE水平均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 APL处理前后的MPE比较

2.3APL处理对基础TFL的影响 对照组及APL处理组d0时TFL水平的差异无统计学意义(P>0.05)；对照组和APL-L组各时间点TFL水平的差异亦无统计学意义(P>0.05)；APL-M组和APL-H组d6～d8时的TFL水平均高于d0，且APL-M组和APL-H组d6～d8时的TFL水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 APL处理前后的基础TFL比较

2.4APL处理对p-p38 MAPK和p-ERK水平的影响 对照组和APL-L组p-p38 MAPK和p-ERK水平的差异亦无统计学意义(P>0.05)；APL-M组和APL-H组的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于对照组和APL-L组，且APL-H组的两蛋白水平均低于APL-L组和APL-M组(P<0.05)。见表4，图1。

表4 APL处理前后p-p38 MAPK和p-ERK水平比较

与对照组比较：1)P<0.05

A～D：对照组，APL-L组，APL-M组，APL-H组图1 各组p-p38 MAPK和p-ERK表达的免疫组化图

3 讨 论

吗啡等阿片类药物是临床常用的麻醉性镇痛药物，长期使用可导致耐药，常见表现为痛觉过敏、起效时间缩短及镇痛效能下降〔8〕，不仅影响了阿片类药物的应用，而且增加了患者的身心负担〔9〕。阿片受体在痛觉传导的调节中起着重要的作用，新近研究发现Apelin对阿片信号通路有潜在的影响〔10〕。Befort 等〔11〕的研究发现吗啡依赖小鼠下丘脑外侧中的 Apelin mRNA水平降低。μ阿片受体激活是导致了Apelin转录水平下降，且μ阿片受体也介导了APL的镇痛作用〔12〕，以上表明APL与μ阿片受体的潜在关系。吗啡已被广泛用于治疗各种急性疼痛和长期重度慢性疼痛。然而，有些患者仍未能得到很好的保护，由于反复使用后诸如成瘾等毒副作用的出现，同时耐受的产生直接导致疗效下降。为提高吗啡的镇痛作用，临床上常尝试联合另一种具有镇痛作用的药物〔13〕。

本研究提示APL在一定浓度下可增强吗啡的镇痛效能，有助于对改善吗啡耐受。本研究的另一个发现为APL本身具有较好的镇痛作用。此外，APL对增强吗啡镇痛作用的效果确切。本研究从另一个方面也表明APL对μ阿片受体参与的信号通路有一定的潜在影响，提示APL可能对包括吗啡在内阿片类药物均有较好的镇痛增强效果。

丝裂原激活的蛋白激酶包括p38 MAPK及ERK等多个成员，p38 MAPK与神经病理性疼痛密切相关，如周围神经性疼痛时脊髓中的p38 MAPK表达显著升高〔14〕，且抑制p38 MAPK活化可减轻机械痛敏和热痛敏症状。p38 MAPK及ERK激活在吗啡耐受时发挥了重要作用，如鞘内持续注射p38 MAPK抑制剂可促进吗啡耐受的形成〔15〕，而吗啡耐受大鼠多个脑区和脊髓中ERK激活〔16〕。本研究结果显示0.5、5 μg APL处理可降低大鼠的p-p38 MAPK和p-ERK水平，且随着剂量的升高，两蛋白磷酸化水平越低，表明APL可限制p38 MAPK和ERK的活化，可能为其发挥镇痛效能的方式之一。

1谭丽艳,齐亚灵,李洪源,等.初诊老年肥胖2型糖尿病患者血清nesfatin-1及apelin水平与胰岛素抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(8):2034-5.

2李 卫,周筱筠,卢先州,等.重症急性胰腺炎大鼠血清Apelin、C反应蛋白及肿瘤坏死因子-α水平变化及临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(9):2080-2.

3Kumar P,Ashokan A,Aradhyam GK.Apelin binding to human APJ receptor leads to biased signaling〔J〕.Biochim Biophys Acta,2016;1864(12):1748-56.

4Salska A,Chizynski K.Apelin-a potential target in the diagnosis and treatment of the diseases of civilization〔J〕.Acta Cardiol,2016;71(5):505-17.

5Turtay MG,Karabas M,Parlakpinar H,etal.The analgesic effect of apelin-13 and its mechanism of action within the nitric oxide and serotonin pathways〔J〕.Hippokratia,2015;19(4):319-23.

6Canpolat S,Ozcan M,Saral S,etal.Effects of apelin-13 in mice model of experimental pain and peripheral nociceptive signaling in rat sensory neurons〔J〕.J Recept Signal Transduct Res,2016;36(3):243-7.

7李永乐,谢军明,舒银银,等.瑞舒伐他汀部分恢复吗啡耐受大鼠的吗啡镇痛效能〔J〕.中国药理学通报,2013;29(1):64-8.

8Zhao J,Wang H,Song T,etal.Thalidomide promotes morphine efficacy and prevents morphine-induced tolerance in rats with diabetic neuropathy〔J〕.Neurochem Res,2016;41(12):3171-80.

9Ahmadi S,Rafieenia F,Rostamzadeh J.Morphine-induced analgesic tolerance effect on gene expression of the NMDA receptor subunit 1 in rat striatum and prefrontal cortex〔J〕.Basic Clin Neurosci,2016;7(3):241-8.

10Xu N,Wang H,Fan L,etal.Supraspinal administration of apelin-13 induces antinociception via the opioid receptor in mice〔J〕.Peptides,2009;30(6):1153-7.

11Befort K,Filliol D,Darcq E,etal.Gene expression is altered in the lateral hypothalamus upon activation of the mu opioid receptor〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2008;1129:175-84.

12Yang YJ,Lv SY,Xiu MH,etal.Intracerebroventricular administration of apelin-13 inhibits distal colonic transit in mice〔J〕.Peptides,2010;31(12):2241-6.

13Lazarus LH,Okada Y.Engineering endomorphin drugs:state of the art〔J〕.Exp Opin Ther Pat,2012;22(1):1-14.

14Chen NF,Chen WF,Sung CS,etal.Contributions of p38 and ERK to the antinociceptive effects of TGF-β1 in chronic constriction injury-induced neuropathic rats〔J〕.J Headache Pain,2016;17(1):72.

15王 芬,谢 滔,江姿潞,等.鞘内注射重组大鼠脂质运载蛋白-2对大鼠吗啡镇痛效能的影响〔J〕.临床麻醉学杂志,2015;31(9):896-900.

16Wang Z,Ma W,Chabot JG,etal.Cell-type specific activation of p38 and ERK mediates calcitonin gene-related peptide involvement intolerance to morphine-induced analgesia〔J〕.FASEB J,2009;23(8):2576-86.

青海省重大科技专项(2016-SF-A5)

樊海宁(1970-)，男，教授，博士生导师，主要从事肝胆胰疾病的临床与基础研究。

郭延洪(1982-)，男，主治医师，主要从事临床麻醉研究。

R614

A

1005-9202(2017)20-4966-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.005

〔2017-02-15修回〕

(编辑 徐 杰)