艾拉莫德对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜细胞核因子-κB信号的影响

黄 颖 姚血明 马武开 唐 芳

(贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科,贵州 贵阳 550001)

艾拉莫德对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜细胞核因子-κB信号的影响

黄 颖 姚血明 马武开 唐 芳

(贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科,贵州 贵阳 550001)

目的研究艾拉莫德(T-614)对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠核因子(NF)-κB信号的影响。方法将40只大鼠随机分成空白组，模型组，甲氨蝶呤(MTX)对照组，T-614治疗组，每组10只。造模后，采用RT-PCR及Western印迹法检测T-614对CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P50、NF-κB/P65、IκBα基因及蛋白水平的影响。结果T-614可下调CIA大鼠滑膜细胞NF-κB/P50、NF-κB/P65的表达，上调IκBα的表达，与模型组比较有统计学差异(P<0.01)；T-614治疗组优于MTX对照组(P<0.01或P<0.05)。结论T-614可通过降低CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P50、NF-κB/P65表达，升高IκBα表达以达到控制关节炎的作用。

艾拉莫德(T-614)；Ⅱ型胶原诱导性关节炎；核因子-κB信号

类风湿关节炎(RA)发病始动机制至今仍不清楚，近年来研究发现，核因子(NF)-κB作为炎症反应的关键信号传导因子，在炎症细胞因子介导的炎症反应中起中心作用〔1，2〕，NF-κB信号通路的激活在RA发生发展过程中发挥重要作用〔3〕。艾拉莫德(T-614)作为我国完全自主知识产权的具有独特作用机制的小分子抗风湿药，相关临床实验证实其具有良好疗效及安全性〔4〕，现已广泛应用于RA的临床治疗。甲氨蝶呤(MTX)是一种改善病情的抗风湿药物(DMARD)，是RA初始治疗中的金标准药物。相较于MTX起效慢、耐药率逐渐升高，T-614在临床使用中体现出相应的优势。T-614主要作用机制之一是抗感染作用，本实验通过建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠，研究T-614对 CIA 模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB信号的影响，探讨其在治疗RA过程中减轻滑膜炎症的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 6周龄40只健康清洁级雌性Wistar大鼠，体重(170±15)g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要试剂 牛Ⅱ型胶原(批号C7806-2)、弗氏完全佐剂(批号F5881)，美国Sigma公司；Trizol(批号15596-018)，Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒(批号#K1622)、SYBRGreen/FlouresceinqPCRMasterMix(2×)(批号#K0242)，Fermentas公司；Ex TaqTM(批号DRR100A)、DL2000 DNA Marker (批号D502A)，TAKARA公司；GAPDH抗体(批号AB-P-R 001)，杭州贤至生物有限公司；NF-κB P65抗体(批号8242)，美国CST公司；NF-κB P50抗体(批号ab7971)，abcam公司；IκBα抗体(批号10268-1-AP)、HRP标记羊抗兔二抗(批号BA1054)，武汉三鹰生物技术公司。艾拉莫德片，先声药业有限公司，批准文号：国药准字H20110084；MTX，上海信谊药厂有限公司，批准文号：国药准字H31020644。

1.3动物分组 将大鼠随机分为4组，每组10只，①空白组；②模型组；③T-614治疗组；④MTX对照组。

1.4模型制备 按照参考文献〔5〕将牛Ⅱ型胶原溶于0.1%冰醋酸中，按比例与弗氏完全佐剂1∶1充分混和乳化，于Wistar大鼠右后足跖肉垫内注射0.4 ml，第8天以相同乳剂级剂量于大鼠尾根部加强注射。空白组不予任何处理。

1.5给药 从造模第1天开始用药。T-614：10 mg/kg，1次/d，MTX：1 mg/kg，1次/w，给药时将药溶于2 ml生理盐水内。空白组、模型组均灌胃2 ml生理盐水。共给药4 w。

1.6RT-PCR 取-80℃冰箱中保存的细胞，用Trizol法提取总RNA，测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度，根据比值估测RNA质量，比值在1.8～2.0满足实验要求。将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。用cDNA第一链合成试剂盒，按照试剂盒操作说明，用2.5 μl总RNA合成单链cDNA。然后取5 μl cDNA加入20 μl PCR反应体系中进行扩增，置于-20℃保留备用。反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30个循环；72℃ 4 min。RT-PCR引物序列:β-actin (240 bp)：前向：CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反向：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT；Rat Nfkb(253 bp)：前向：GGCAGCACTCCTTATCAACC，反向：TAGAGGTGTCGTCCCATCGT；Rat IκBα(136 bp)：前向：ATGGCTACCTGGGCATCGTG，反向：TTCAACAGGAGCGAGACCAG。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40个循环，反应结束后电脑自动分析计算结果。以β-actin 为内参，每个样本重复测量3次，以2-△△CT进行分析，取3个样本测定结果的平均值。

1.7Western印迹法 将滑膜组织加400 μl裂解液进行裂解、匀浆，提取核蛋白，避光孵育后测定OD值，计算样品蛋白浓度。将样品蛋白上样于泳道中，导入电泳液进行电泳，在冰浴中电转移至PVDF 膜，封闭2 h后，加入PBS浸泡，37℃孵育30 min，加入一抗孵育过夜。充分洗涤后加入二抗孵育2 h。再次充分洗涤后加酶，X线胶片压片后，显影、定影。冲洗、晾干、扫描胶片，用BandScan软件分析胶片灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件，计量资料符合正态分布满足方差齐性者采用单因素分析，不符合采用非参数(秩和)检验。

2 结 果

2.1T-614对CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB、IκBα mRNA表达的影响 与空白组相比，模型组NF-κB表达升高(P<0.01)；与模型组相比，T-614治疗组NF-κB表达下降(P<0.01)；与MTX对照组相比，T-614治疗组具有统计学差异(P<0.05)。与空白组相比，模型组IκBα表达下降(P<0.01)；与模型组相比，T-614治疗组IκBα表达有不同程度上升(P<0.01)；与MTX对照组相比，T-614治疗组具有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠滑膜组织中NF-κB、IκBα基因表达

与空白组相比:1)P<0.01；与模型组相比:2)P<0.01；与MTX对照组相比:3)P<0.05

2.2T-614对NF-κB信号蛋白水平的调控 与空白组相比，模型组NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度值明显升高(P<0.01)；与模型组相比，T-614治疗组NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度比值不同程度下降(P<0.01)；与MTX对照组相比，T-614治疗组具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。与空白组相比，模型组IκBα蛋白灰度比值下降(P<0.01)；与模型组相比，T-614治疗组IκBα蛋白灰度比值上升(P<0.01)；与MTX对照组相比，T-614治疗组具有统计学差异(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠滑膜组织中NF-κB、IκBα蛋白表达

与空白对照组相比：1)P<0.01；与模型对照组相比：2)P<0.01；与MTX对照组相比：3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

RA是临床最常见的自身免疫性疾病，具有发病率高、致残率高的特点，严重影响人类健康，其发病与免疫功能异常密切相关〔6，7〕。NF-κB普遍存在于真核细胞内，是介导许多免疫和炎症反应的中心物质，参与多种相关基因的转录调控而发挥作用〔8，9〕。在RA 的滑膜细胞中，免疫活性NF-κB蛋白P50和P65大量表达，与其调控的细胞因子一起积极参与了关节炎症及损伤反应等病理进程，在RA的发病中起关键作用〔10，11〕。当细胞处于静息状态时，NF-κB与其抑制蛋白IκB形成复合物，以无活性的形式存在于胞质中〔12〕，IκB功能主要是对NF-κB的活化起抑制作用。当细胞受到细胞外信号如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、脂多糖(LPS) 、氧自由基等〔13〕刺激时，可通过降解IκB而激活NF-κB，并很快启动基因转录和蛋白合成〔14〕。活化的NF-κB增强很多炎症介质，如TNF-α、IL-1β等的表达，而TNF-α、IL-1β等又可进一步激活NF-ΚB的表达，两者构成正反馈机制，导致RA关节炎症及关节结构破坏得以维持与进展〔15，16〕。因此，阻断RA患者病理状态下NF-κB的活化，可以阻断疾病的发展。本课题研究提示，NF-κB可能与CIA模型鼠关节滑膜炎症的发生发展密切相关。T-614是一种新型的具有多作用靶点的缓解病情类药物，属甲磺酸苯胺族中的一员，这个家族中大部分成员主要表现为对环氧化酶(COX)-2的抑制作用，但越来越多的相关研究已证明T-614具备与众不同的免疫调节作用。本次实验发现T-614及MTX均可下调CIA模型鼠关节滑膜NF-κB表达，上调抑制蛋白IκBα的表达，在同一时间点，T-614作用优于MTX，提示T-614可能通过靶向调控NF-κB信号表达，抑制NF-κB信号通络的活化，下调相关炎症细胞因子的水平，从而发挥治疗RA的作用。结合目前对于T-614的诸多临床研究，对于MTX治疗效果不佳或副作用不能耐受的患者，T-614将成为一种更好的选择。

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TheeffectofT-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl)methanesulfonamideonnuclearfactor-κBsignalofarticularsynovialcellsincollageninducedarthritismodelrats

HUANGYing,YAOXue-Ming,MAWu-Kai,etal.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangUniversityofChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of T-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl) methanesulfonamide on nuclear factor (NF)-κB signal of articular synovial cells in collagen induced arthritis (CIA) model rats.Methods40 rats were randomly divided into blank control,model control, methotrexate (MTX), T-614 treatment groups, each group with 10 rats.RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of NF-κB/P50, NF-κB/P65, IκBα in each group.ResultsT-614 down-regulated the expressions of NF-κB/P65 and NF-κB/P50,up-regulated the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats(P<0.01);the effects in T-614 treatment group were better than those of MTX control group(P<0.01 orP<0.05).ConclusionsT-614 could lower the expressions of NF-κB/P50 and NF-κB/P65,upregulate the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats,through these ways,it could control arthritis.

T-614;Collagen induced arthritis;Nuclear factor-κB signal

国家自然科学基金资助项目(81460727)；贵州省社会攻关项目(黔科合SY字(2013)3048号)；贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字〔2015〕7259号)

姚血明(1984-)，男，副主任医师，主要从事中西医结合防治风湿免疫病研究。

黄 颖(1982-)，女，主治医师，主要从事中西医结合防治风湿免疫病研究。

R6

A

1005-9202(2017)20-4964-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.004

〔2016-11-19修回〕

(编辑 李相军)