莲初生叶发育过程显微观察

徐国鑫 ，尹静静 ，王茜 ，李效尊 ，高洁 ，阴筱 ，吴修

（1.山东省水稻研究所/山东省农业科学院水生生物研究中心，济南，250100；2.山东济宁市微山县农业局）

莲初生叶发育过程显微观察

徐国鑫1，尹静静1，王茜2，李效尊1，高洁1，阴筱1，吴修1

（1.山东省水稻研究所/山东省农业科学院水生生物研究中心，济南，250100；2.山东济宁市微山县农业局）

利用树脂切片技术，分析了莲初生叶不同发育时期的内部结构，发现初生叶的腹面具有乳突结构，乳突细胞下层具有结构特殊的栅栏状细胞；靠近下表皮的部分细胞特化为分泌细胞，其液泡中的分泌物质经历了先积累再消耗的变化过程。

莲；初生叶；发育；显微结构

莲（Nelumbo nucifera Gaertn.），又名莲藕、荷、水芙蓉等，是莲科莲属多年生水生植物，主要分布于我国热带、亚热带和温带淡水资源丰富的湖泊和沼泽等地区。莲的叶片又称为荷叶，其颜色青绿，气味芬芳，含有莲碱（Roemerine）、原荷叶碱（Pronuciferine）和荷叶碱（Nuciferine）等多种生物碱及维生素，自古就是药膳中经常选用的原料。传统医学认为，荷叶苦平，归肝、脾、胃，具有清解暑热、升发清阳、凉血止血的作用，可以用于暑热烦渴、暑湿泄泻、便血便漏[1]。近代研究表明，荷叶有良好的降血脂、降胆固醇和减肥的作用[2～4]。

近年来，对荷叶的研究主要集中于其物质成分和药用价值方面，关于荷叶结构和发育过程的研究较少，陈维培等[5]和李长春等[6]研究认为莲的叶片有3种形式，分别为沉水叶、浮水叶和挺水叶，3种类型叶片的显微结构有不同。刁英等[7]对10份莲属植物进行了研究，认为莲属植物的叶片均有明显的栅栏组织和海绵组织之分，但细胞结构紧密度（CTR）有一定的差别。目前尚缺少关于莲叶片（荷叶）发育过程和精细结构的研究。本研究利用树脂切片结合组织化学技术，分析了莲初生叶不同发育时期的内部结构，观察了莲初生叶中特殊的栅栏状细胞和分泌细胞的发育过程，并对其功能进行了讨论。

1 材料与方法

1.1 试验材料

莲野生品种微山红莲种植于山东省农业科学院饮马泉试验基地水泥池中，于2016年秋季采收成熟的莲籽。将莲籽破壳后浸泡于4～5 cm深的清水中，置于28℃的培养箱中，16 h光照、8 h黑暗培养。 取吸涨后2、4、6、8 d的初生叶（第一片真叶）为材料。

1.2 试验方法

①试剂 a.戊二醛固定液。2.5%戊二醛溶液，用0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH值6.8）配制。

b.番红染色液。1 g番红溶于10%乙醇，加入4mL苯胺油，用10%乙醇定容至100mL，50℃加热溶解，冷却至室温后用滤纸过滤。

c.改良甲苯胺蓝染色液。称取0.5 g甲苯胺蓝，加入 100 mL 30%的乙醇，加热至 65℃，搅拌30min，滤纸过滤后避光保存。

②制片与染色 树脂切片方法参照Wei等[13]的方法，将莲藕叶片切成边长1 mm的小块，经脱水、树脂包埋后获得3μm厚的切片。将粘附有树脂切片的载玻片浸入番红染色液中染色6 h，自来水冲洗，蒸馏水浸洗2次，每次3 min；再浸入甲苯胺蓝染色液中，染色10min，自来水冲洗，蒸馏水浸洗2次，每次5min，35℃烘干。中性树胶封片，镜检拍照。

2 结果与分析

2.1 莲初生叶发育过程

莲籽吸涨后2 d，初生叶开始突出果皮，叶柄为弯曲状态；吸涨后4 d，初生叶及叶柄伸出果皮5～10 cm，叶片为卷曲状态；吸涨后6 d，叶柄伸出果皮10～20 cm，叶片仍为卷曲状态。吸涨后8 d，初生叶展开，直径4～5 cm。

图1 莲初生叶表皮及叶肉细胞发育过程

2.2 莲初生叶发育过程显微结构

在显微镜下观察吸涨后2 d的初生叶横切面，可以看到腹面的第一层细胞高度约为15μm，表面已经发育出小乳突。第二层细胞截面呈较规则的正方形，这层细胞之下有2～3层排列较为紧密的叶肉细胞，形状呈不太规则的多边形，之后的4～6层细胞具有比较明显的海绵组织特征，细胞间形成10～20μm的空隙；初生叶背面的2层细胞形状规则，叶片背面无乳突（图1A）。

吸涨后4 d，叶片腹面第1层乳突细胞的高度达到约20μm；第2层细胞细胞质浓厚，细胞核位于细胞中央，细胞内未见明显的淀粉粒。叶肉细胞体积增大，内部可见较多的淀粉粒，小液泡开始融合。海绵组织间的空隙扩大到50μm以上。靠近下表皮的一层叶肉细胞中，有大约一半细胞开始在液泡内部积累染色较深的分泌物质，特化为分泌细胞（图 1B、E，图 2A）。

图2 莲初生叶分泌细胞发育过程

吸涨后6 d，腹面的第2层细胞伸长为短棒状，液泡位于细胞两端，细胞核位于细胞中央，这层细胞排列紧密、形似栅栏，由于细胞质浓厚被染成深蓝色。叶片内部的叶肉细胞形成中央大液泡。分泌细胞液泡中的分泌物质累积呈液滴状 （图1C、F，图 2B）。

吸涨后8 d，初生叶完全展开，腹面的乳突细胞膨大呈水滴状。腹面第2层细胞的细胞核仍位于细胞中央，并且含有较浓厚的细胞质。叶肉细胞被大液泡充满，细胞质和细胞核被推挤到细胞边缘。分泌细胞液泡中染色较深的物质基本消失，叶片表现为成熟叶片的结构 （图1D、G，图 2C）。

3 讨论与结论

有研究认为，莲有3种类型的叶片，分别为沉水叶、浮水叶和挺水叶[5,6]，但我们在对莲长期的种植及研究中并没有观察到沉水叶的存在。莲籽萌发后，子叶并不突破果皮，第1、2片真叶依次突出种皮，并在节上着生不定根；从第一片真叶开始，前期的数张叶片均为浮水叶，后期出现的叶片均为挺水叶。据此我们认为，莲只有浮水叶和挺水叶2种类型的叶片，所谓的“沉水叶”可能是一些浮水叶尚未穿透水面的早期生长阶段。浮水叶和挺水叶结构差异尚需进一步研究。

已有报道莲属植物的叶片均有明显的栅栏组织和海绵组织之分[7,9]，但是尚未见对莲叶片结构的详细描述。本研究发现，莲初生叶腹面的第一层细胞形成乳突，第二层细胞逐渐发育为短棒状，其排列紧密、形似栅栏，但是这层细胞内部结构比较特殊，其细胞质浓厚，细胞核位于细胞中央而液泡位于细胞两端，在光镜下未观察到淀粉粒，目前不能确定是否含有叶绿体（图1C、F）。由此可见，除外形像栅栏细胞外，这层细胞的内部结构与常见的叶肉栅栏组织差别较大，有可能是复表皮（Multiple epidermis）结构的一部分，其超微结构需进一步借助透射电镜进行观察。

靠近下表皮的分泌细胞的液泡中，在吸涨后第3～4 d可以观察到分泌物质的积累，到叶片展开前达到最多，叶片展开后分泌物质减少。分泌物质的积累过程恰好是初生叶不断生长、穿过水层的阶段，推测这些分泌物质可能参与莲初生叶穿透水层阶段的防御，但分泌物质的成分尚需要进一步研究。

[1]国家药典委员会．中国药典（一部）[M]．北京：化学工业出版社，2000：231．

[2]范婷婷，法鲁克，方芳，等.荷叶总生物碱降脂减肥作用的体内外试验[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2013，39（2）：141-148.

[3]王俊杰，舒洋，龙婷，等.荷叶黄酮治疗小鼠非酒精性脂肪肝的研究[J].中药药理与临床，2011（2）：61-64.

[4]Zeng Z H,Yun Xu,Zhang B.Antidiabetic activity of a lotus leaf Selenium (Se)-polysaccharide in rats with gestational diabetes mellitus[J].Biological Trace Element Research,2017,176(2)：321-327.

[5]陈维培，张四美.莲的生态解剖学研究[J].生态学报，1988，8（3）：277-282.

[6]李长春，黄天芳.莲的形态结构及个体发育概述[J].生物学教学，2013，38（1）：4-5.

[7]刁英，胡蓉，游永宁，等.莲属植物叶片及花瓣的比较解剖学研究[J].湖北农业科学，2013，52（13）：3 059-3 061.

[8]Wei N,Tan C,Qi B,et al.Changes in gravitational forces induce the modification of Arabidopsis thaliana silique pedicel positioning[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(14)：3 875-3 884.

[9]陈维培，张四美.睡莲科叶比较解剖[J].植物分类学报，1992，30（5）：415-422.

Microscopic Observation on Development of Primary Leaves of Lotus Seed lings

XU Guoxin1,YIN Jingjing1,WANG Qian2,LIXiaozun1,GAO Jie1,YIN Xiao1，WU Xiu1
(1.Shandong Rice Research Institute/Hydrobiology Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100;2.Agricultural Bureau of Weishan County in Jining City of Shandong)

In this study,the tissue and cell structure of lotus primary leaves at different development stages were clearly analyzed by semi-thin sections.The results showed that papilla structure only existed on the dorsal side of primary leaves,and beneath that was one layer of palisade cells with special structure inside.Somemesophyll cells were adjacent to lower epidermis specialized to secretory cells,with secretory material inside firstly accumulated and then consumed.

Lotus;Primary leaves;Development;Microstructure

S645.4

A

1001-3547（2017）18-0108-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.032

山东省自然科学基金（ZR2016CP23，ZR2015PC017）资助

徐国鑫（1985-），男，博士，主要研究方向为植物细胞生物学，E-mail：xuguoxin1985@163.com

吴修，男，通讯作者，研究员，主要研究方向为作物栽培学，电话：0531-83179090，E-mail：wuxiu9090@163.com

2017-08-21