莲藕品种资源InDel指纹图谱的构建

律文堂 ，尹静静 ，刘蓬 ，刘永 ，吴宝杰 ，吴修 ，李效尊

（1．山东省水稻研究所/山东省农业科学院水生生物研究中心，济南，250100；2．山东鱼台县农业局；3．山东茌平县胡屯镇农业技术推广站）

莲藕品种资源InDel指纹图谱的构建

律文堂1，尹静静1，刘蓬1，刘永2，吴宝杰3，吴修1，李效尊1

（1．山东省水稻研究所/山东省农业科学院水生生物研究中心，济南，250100；2．山东鱼台县农业局；3．山东茌平县胡屯镇农业技术推广站）

利用自主开发的莲藕高多态性InDel标记，对山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃中15个代表性莲藕品种资源进行分子标记分析。结果表明，利用InD38、InD61等7对引物组合即可区分该15个品种资源，并构建了各个品种的InDel指纹图谱，为莲藕品种鉴定和育种研究提供了技术支持。

莲藕；品种资源；InDel；指纹图谱

莲藕（Nelumbo nucifera Geartn.）是我国栽培面积最大的水生蔬菜。根据生产用途不同，栽培莲可分为花莲、子莲和藕莲，藕莲和子莲的全国栽培面积分别为40万、10万hm2左右，藕莲主要集中在湖北、江苏等长江中下游地区，近年来，黄河流域栽培面积发展较快[1]。山东莲藕种植历史悠久，地方名优品种众多，其中以藕莲为主，省内17个地级市均有莲藕分布，全省莲藕种植面积在5.33万hm2左右，年产值近30亿元，居我国北方各省之首。莲藕的表型性状，尤其是根状茎性状受种植方式和环境的影响较大，仅靠形态性状鉴定的传统手段很难达到精准鉴定的要求，相同材料不同记名等问题时有发生。

目前DNA分子标记已广泛应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各个方面。近些年莲藕SSR和SNP标记被相继开发，遗传连锁图谱也初步构建完成[2～4]，为莲藕种质资源相关研究奠定了良好的基础。采用分子标记的方法，绘制莲藕品种DNA指纹图谱，已成为莲藕种质资源鉴定的理想解决方案。

本研究利用实验室前期开发的高多态性InDel（Insertion and Deletion，插入缺失）分子标记对山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃保存的15个代表性莲藕品种资源进行了指纹图谱绘制，以便为莲藕品种资源鉴定保护和育种实践提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为山东省农业科学院水生生物研究中心莲藕种质资源圃中15份代表性品种资源，具体如下：鄂莲4号、鄂莲5号、鄂莲7号、齐头、微山红莲、美人红、大卧龙、大青秸、州城莲藕、东平莲藕、桓台莲藕、鱼台莲藕、吴家堡莲藕、太空莲36号、芙蓉秋色。该15份材料经性状调查并结合RAPD遗传多样性分析[5]综合确定。

1.2 DNA的提取

采用改良CTAB法，主要步骤如下：取200 mg叶片，加入0.8mLDNA提取缓冲液（包括2.5%CTAB，20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris，1%（m/v） PVP）研磨成匀浆，65℃水浴 30 min；加入等体积氯仿，颠倒混匀，12 000 r/min离心10min；取上清液加入等体积预冷异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀20min；10 000 r/min离心15min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀5 min；短暂离心后倒掉上清液，沉淀自然风干后加适量TE溶解。

1.3 PCR体系

PCR扩增反应总体积为10μL，其中反应混合液中包括：5μL的 2×Easy Taq PCR Super Mix for PAGE （北京全式金），DNA （100 ng/μL）模板 0.5 μL，引物 0.5μL（10μmol/L），4μL的ddH2O。PCR扩增反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共 35个循环；最后 72℃延伸5 min。

1.4 PCR产物检测

PCR产物使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离检测，电泳完毕后采用银染显影，主要步骤如下：电泳结束后，轻轻剥下凝胶，用蒸馏水洗两次；银染：硝酸银染色液 （500 mL H2O+1 g AgNO3），轻轻摇动，染色 15min，用蒸馏水洗2次；显色：显色液（100 mL H2O+1.5 g NaOH+0.5 mL 甲醛），显色时需随时观察，待条带清晰即可；倒掉显色液，用蒸馏水润洗凝胶，中止显色反应后拍照存档。

1.5 数据分析

根据每个InDel标记检测出等位变异的有无，分别以0和1记载各品种的InDel等位变异，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0。

2 结果与分析

2.1 InDel标记多态性分析

利用两个莲藕品种（齐头、太空莲36号）基因组重测序数据和中国古代莲参考基因组做序列比对分析，筛选出三者间均有差异的InDel位点，设计并验证适合PAGE检测的引物。在基因组定位的基础上，筛选出一组在各染色体上均匀分布的46对标记引物 （数据未发表）。

上述46对引物对15个莲藕品种资源DNA进行PCR扩增显示，46对引物均能检测到多态性条带，共检测出133个多态性位点，每对引物扩增出的等位基因数目不等，变幅为2～5个，图1为引物InD78扩增结果。

图1 InD78扩增结果

表1 InDel标记引物名称及序列

表2 15个莲藕品种资源的InDel指纹图谱

2.2 莲藕品种资源DNA指纹图谱的构建

对各品种资源InDel多态性条带分析发现，鄂莲7号、微山红莲、州城莲藕、鱼台莲藕、吴家堡莲藕、芙蓉秋色分别在引物 InD108、InD78、InD61、InD84、InD62、InD98检测图谱中有特征谱带，太空莲36号在引物InD84和InD98检测图谱中均有特征谱带。除上述7个品种外，其他8个品种都不具有单一引物扩增的特征谱带，但是仅利用InD38、InD61、InD62、InD78、InD84、InD98、InD108 7 对 引物组合（表1）即可将15个品种资源完全区分开来。利用上述7对引物扩增，构建了15个莲藕品种的DNA指纹图谱（表2）。

3 讨论与结论

InDel标记在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点，并且其分布密度远高于SSR，理论上讲SSR标记包含在InDel标记范畴内。随着基因组学及生物信息学的发展，公共数据如EST、cDNA和基因组序列等信息大量出现，使得通过生物信息学方法得到候选InDel成为可能。该类标记一个显著的优点在于基于多个品种DNA序列信息开发的品种间InDel多态标记成功率高，而且不需要类似SSR标记的多态引物筛选过程，工作效率显著提升，目前已在水稻、玉米等主要作物中得到广泛应用[6]，但在莲藕中还没有相关报道。本研究利用己筛选出的46对InDel引物对15个莲藕品种资源进行遗传分析，所有引物在15个品种内均检测到多态性条带，只需要7对引物即可区分所有检测莲藕品种资源，并基于此构建了其DNA指纹图谱。

通过开发莲基因组的有效InDel引物，建立基于InDel分子标记分析莲种质资源遗传多样性的技术平台，构建莲藕品种资源的InDel指纹图谱，可以为莲藕种质资源研究提供分子遗传学依据，指导育种中合理选配亲本，减少育种的盲目性，加快遗传改良进程，同时为品种的鉴定和知识产权的保护等提供技术支持。

[1]柯卫东，黄新芳，李建洪，等.我国水生蔬菜科研与生产发展概况[J].长江蔬菜，2015（14）：33-37.

[2]Yang M,Han Y,VanBuren R,et al.Genetic linkage maps for Asian and American lotus constructed using novel SSR markers derived from the genome of sequenced cultivar[J].BMC Genomics,2012,13(1)：1-11.

[3]Hu J,Gui S,Zhu Z,et al.Genome-wide identification of SSR and SNP markers based on whole-genome resequencing of a Thailand wild sacred lotus(Nelumbo nucifera)[J].PloSOne,2015,10(11)：1-17.

[4]Liu Z,Zhu H,Liu Y,et al.Construction of a high-density,high-quality genetic map of cultivated lotus(Nelumbo nucifera)using next-generation sequencing [J].BMC Genomics,2016,17(1)：466-470.

[5]尹静静，李效尊，阴筱，等.山东莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）种质资源的RAPD鉴定和遗传多样性分析[J].分子植物育种，2015，13（6）：1 323-1 328.

[6]初志战，郭海滨，曾栋昌，等.籼粳稻基因组295个InDel标记的开发[J].作物学报，2016（6）：932-941.

Construction of M olecular Fingerprint for Lotus Cultivar by InDel Markers

LVWentang1,YIN Jingjing1,LIU Peng1,LIU Yong2,WU Baojie3,WU Xiu1,LI Xiaozun1
(1.Shandong Rice Research Institute/Hydrobiology Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,250100;2.Agricultural Bureau of Yutai County in Shandong Province;3.Hutun Town Agricultural Technology Extension Station in Chiping County of Shandong)

Using the self-developed high polymorphism In Delmarkers of lotus root to analyze 15 representative cultivars that came from research center of Shandong Academy of Agricultural Sciences Aquatic Organisms in lotus root germplasm nursery with molecular marker analysis.The results showed that all the 15 lotus cultivas could be identified by 7 pairs of InDel marker primers(InD38,InD61,etc.)and the InDel fingerprint of each cultivar was constructed.This study will provide technical support for identification and breeding of lotus cultivars.

Lotus;Cultivars;InDel;Fingerprint

S645.1

A

1001-3547（2017）18-0094-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.027

山东省农业科学院青年科研基金项目（2014QNM32）；山东省科技发展计划（2014GNC110015）；国家自然科学基金项目（31601650）

律文堂，男，博士，助理研究员，主要从事植物遗传育种工作，E-mail：lvwentang2015@163.com

李效尊，男，通讯作者，博士，副研究员，主要从事水生蔬菜研究，电话：0531-83178067，E-mail：xiaozunli@163.com

2017-07-27