柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

王兴红

(1.中国林业科学研究院，华北林业实验中心，北京 102300；2.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058)

柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

王兴红1，2

(1.中国林业科学研究院，华北林业实验中心，北京 102300；2.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058)

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌，在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物，以ITS4作为下游引物，并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选，对引物的灵敏度进行了验证，并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明，在退火温度为60 ℃时，引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带，引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带，引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带，不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明，引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg，引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此，利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4，结合简单的病原菌基因组DNA提取方法，可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。

柑橘黑斑病；柑橘黑斑病菌；中国柑橘叶点霉菌；首都叶点霉菌；特异性引物

柑橘黑斑病(Citrusblack spot，CBS)，由柑橘黑斑病菌(Phyllostictacitricarpa，有性态为柑橘球座菌Guignardiacitricarpa)引起，病原菌主要侵染柑橘的果实并在果皮上形成多种类型的病斑而导致柑橘果实的商品性下降[1-5]。柑橘黑斑病在澳洲、南美洲、南非以及我国各柑橘产区发生普遍[6-8]，但该病害尚未在欧盟等地区发生，欧盟、美国等将柑橘黑斑病菌列为A1类禁止入境的有害生物[9]，这些国家对进口的柑橘果实都要进行严格的检验，一旦发现病果即作通报甚至是退货处理。因此，急需能够快速准确鉴定柑橘黑斑病菌的技术，使被检测果实快速通关，防止由于长时间滞留，水果商品量下降，也防止带病菌果实传入其他国家，造成病菌传播。

目前检测柑橘黑斑病的技术包括症状的诊断、利用显微镜检查病原菌、病原菌的传统分离培养和分子生物学快速检测等。症状的诊断和显微镜观察需要丰富的实践经验，而且病害发展初期病斑一般无子实体，错误判断的可能性较大；而传统的分离培养需要至少一周时间，对急需通关的柑橘来说并不实用。因此，Bonants等[10]在ITS区域设计了针对柑橘黑斑病菌的特异性引物GCF3/GCR7，该引物能够快速检测带有分生孢子和没有分生孢子的病斑，该方法优于欧盟的7 d分离培养鉴定方法，但是该方法在单个病斑检测方面效率比较低。Meyer等[11]在ITS区域设计能够区分致病菌-柑橘球座菌和非致病菌-芒果球座菌(Guignardiamangiferae)(经Glienke等[12]研究为首都叶点霉菌(Phyllostictacapitalensis))的特异性引物CITRICI/ITS4和CAMEL2/ITS4，利用该引物结合快速提取病斑基因组DNA的方法，可以在1 d内完成对病原菌的检测，大大缩短了检测时间，但灵敏度较低。Peres等[13]对Bonants和Meyer等[10-11]所设计引物的特异性和灵敏度进行比较，发现这些引物灵敏度较低，尤其在检测单个病斑时，效率非常低，因此Peres等[13]在ITS区域重新设计针对致病性菌-柑橘球座菌和非致病菌-芒果球座菌 (经Glienke等[12]研究为首都叶点霉菌)的特异性引物GCN/GCMR和GMN/GCMR，该引物能够快速有效地对单个病斑进行检测。Mpevan等[14]在ITS区域设计探针，利用Real-time PCR方法检测柑橘黑斑病菌，该方法比传统PCR灵敏度更高，可用于快速准确区分柑橘黑斑病菌和芒果球座菌(经Glienke等[12]研究为首都叶点霉菌)，但该方法受实验室条件的限制较大。Meyer等[15]利用巢式PCR法快速区分南非柑橘上的柑橘黑斑病菌和芒果球座菌 (经Glienke等[12]研究为首都叶点霉菌)，该方法灵敏度高、特异性好，能够对单个病斑的基因组DNA甚至更低浓度的基因组DNA进行检测。Tomlinson等[16]利用环介导等温扩增技术检测柑橘黑斑病菌，该技术具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、操作简便等优点，可以在40 min内完成对病原菌的检测，但该技术易产生假阳性。

虽然上述分子检测方法各有优点，但仅适用于对致病性菌柑橘黑斑病菌和非致病性菌首都叶点霉菌的区分。然而目前发现柑橘上存在5种叶点霉属真菌，即引起柑橘黑斑病的柑橘黑斑病菌[17]，引起柚棕褐斑病(Tan spot)的亚洲柑橘叶点霉菌[18]，伴随2种病害发生的2种内生叶点霉菌，即仅在中国发现的中国柑橘叶点霉菌(Phyllostictacitrichinaensis)[6]和世界各地广泛存在的首都叶点霉菌[19]，以及巴西柑橘叶点霉菌(Phyllostictacitribraziliensis)[12]，在中国柑橘上存在前4种。利用上述分子检测方法无法对中国柑橘上的4种叶点霉属真菌进行区分，检测致病性菌柑橘黑斑病菌的引物同样也能检测非致病性菌中国柑橘叶点霉菌，因此急需设计新的特异性引物区分柑橘上的4种叶点霉属真菌，以免因误判造成不必要的损失。

基于以上分析本研究拟对柑橘上5种叶点霉属真菌和亲缘关系较近的舌下叶点霉菌(Phyllostictahypoglossi)进行序列比对，重新设计针对柑橘黑斑病菌、中国柑橘叶点霉菌和首都叶点霉菌的特异性引物，为检疫性病原菌柑橘黑斑病菌的有效快速检测提供基础。

1 材料和方法

1.1供试菌株

2009-2010年在我国柑橘主产区采集的具有柑橘黑斑病症状或具有柚棕褐斑病症状的果实或叶片，带回实验室进行组织分离与纯化，并进行了形态学和分子生物学鉴定。从经过鉴定的柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌和首都叶点霉菌中选择部分完成柯赫氏法则的菌株进行研究。

本研究中所用的柑橘常见病原菌柑橘绿霉病菌(PenicilliumdigitatumSacc.)、柑橘褐斑病病原菌(Alternariaalternata(Fr.：Fr) Keissler)、柑橘树脂病菌(Diaporthecitri(Fawcett) Wolf)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc)和柑橘脂点黄斑病菌(MycosphaerellacitriWhiteside)，均来自浙江大学农业与生物技术学院园艺植物病理学实验室。

1.2基因组DNA提取

利用真菌基因组提取试剂盒提取供试菌株和病斑基因组DNA，提取的基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测量提取菌株DNA的OD260/280值均在1.8左右，纯度较高，可以满足试验要求。-20 ℃保存备用。

1.3特异性引物的设计

利用DNAman软件对供试菌株柑橘黑斑病菌(ZJUCC200928、ZJUCC200968、ZJUCC200946、NFMJ67)，亚洲柑橘叶点霉菌 (ZJUCC200901、ZJUCC200914、GXSTY102、GDSTY98)，首都叶点霉菌 (ZJUCC200958、ZJUCC200962、ZJWZMG53、GDSTY88)，中国柑橘叶点霉菌 (CGMCC3.14303、CGMCC3.14302、ZJUCC2010100、CQJC64)的 ITS序列以及GenBank中下载的舌下叶点霉菌(CBS101.72)和巴西柑橘叶点霉菌(CBS100098)的ITS序列进行同源性比较，选择同源性低的区域设计上游引物，以ITS4(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA -3′)作为下游引物。在ITS1区域设计柑橘黑斑病菌的上游引物Pc1；同样在ITS1区域设计首都叶点霉菌的上游引物Pct1、Pct3和Pct4；在18S区域设计中国柑橘叶点霉菌的上游引物Pcc1、Pcc3和Pcc6，所设计的引物利用Primer Premier 5.0软件进行检测。退火温度设58，60，65 ℃ 3个梯度。

1.4引物特异性检测及目的条带的克隆

将上述设计的引物与验证模板DNA质量、PCR反应体系的引物ACT-512F/ACT-783R[20]结合，对中国柑橘上4种叶点霉属真菌亚洲柑橘叶点霉菌、柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌以及柑橘常见病害病原菌柑橘脂点黄斑病菌、柑橘褐斑病病原菌、胶孢炭疽菌、柑橘树脂病菌和柑橘绿霉病菌的基因组DNA进行扩增，根据扩增出的条带大小与引物设计时理论条带大小是否一致来判断引物的特异性。将目的条带利用试剂盒回收，并进行克隆和测序，获得的核苷酸序列与GenBank中已知的序列比较，进一步检验扩增出的条带的正确性。

1.5特异性引物灵敏度检验

采用10倍浓度稀释法将模板中国柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和柑橘黑斑病菌基因组DNA用超纯水分别稀释成200 ng/μL、20 ng/μL、2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL、200 ag/μL、20 ag/μL、2 ag/μL 12个不同浓度梯度，对所筛选的引物进行灵敏度检验，以便得到最佳引物组合。

1.6特异性引物对病斑的检测

采集重庆甜橙果园疑似柑橘黑斑病症状果实，以及在广东沙田柚果园采集的疑似柚棕褐斑病症状的柚果和叶片，提取果实和叶片病斑基因组DNA，利用上述设计的柑橘黑斑病菌的特异性引物和亚洲柑橘叶点霉菌的特异性引物Pca8/ITS4进行扩增，进一步验证引物的特异性[6]。

2 结果与分析

2.1特异性引物和退火温度的筛选

将针对中国柑橘叶点霉菌、柑橘黑斑病菌和首都叶点霉菌分别设计的上游引物与ITS4构成引物对。分别以中国柑橘叶点霉菌、柑橘黑斑病菌和首都叶点霉菌为模板，在58，60，65 ℃退火温度分别进行扩增。结果显示，针对中国柑橘叶点霉菌的引物对Pcc1/ITS4，柑橘黑斑病菌的引物对Pc1/ITS4，首都叶点霉菌的引物对Pct4/ITS4(表1)，均在60 ℃退火温度下扩增特异性好、稳定性高(表2)。

表1 特异性上游引物序列Tab.1 Specific upstream primer sequence

表2 不同退火温度引物的特异性Tab.2 The specificity of designed primers in different annealing temperatures

注：Pcc.中国柑橘叶点霉菌; Pc.柑橘黑斑病菌; Pca.亚洲柑橘叶点霉菌; Pct.首都叶点霉菌；++.获得目的条带并且条带清晰明亮；+.获得目的条带但条带清晰度一般；-.未获得目的条带。

Note：Pcc.P.citrichinaensis; Pc.P.citricarpa; Pca.P.citriasina; Pct.P.capitalensis; ++.The target band was amplified and the bands were clear and bright；+.The target band was amplified but the bands were normal; -.The target band was not amplified .

2.2引物的特异性检验

筛选的特异性引物Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4和Pct4/ITS4分别对4株中国柑橘叶点霉菌、4株柑橘黑斑病菌、4株首都叶点霉菌和4株亚洲柑橘叶点霉菌的基因组DNA进行扩增。结果显示，引物Pcc1/ITS4仅能从4株中国柑橘叶点霉菌的基因组DNA中扩增出706 bp的条带，不能从柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和亚洲柑橘叶点霉菌的基因组DNA中扩增出该条带(图1)；引物Pc1/ITS4仅能从供试菌株柑橘黑斑病菌的基因组DNA中扩增出593 bp的条带，在其他菌种的基因组DNA中未扩增出目的条带(图2)；引物Pct4/ITS4仅能从供试菌株首都叶点霉菌的基因组DNA中扩增出551 bp的条带，而不能从其他菌株的基因组DNA中扩增出该条带(图3)。将每个特异性引物扩增出的条带进行克隆回收测序，得到的序列与已知种的相似性达到100%。同时利用这些特异性引物对柑橘常见病害病原菌的基因组DNA进行扩增，均未扩增出任何条带，进一步证明，所设计的引物特异性好。

1～4.4个中国柑橘叶点霉菌菌株; 5～8.4个首都叶点霉菌菌株;9～12.4个亚洲柑橘叶点霉菌菌株;13～16. 4个柑橘黑斑病菌菌株; 260 bp的条带为引物ACT512F/ACT783R扩增产物。

1-4.FourP.citrichinaensisisolatess; 5-8.FourP.capitalensisisolates; 9-12.FourP.citriasianaisolates; 13-16.FourP.citricarpaisolates; The 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

图1引物Pcc1/ITS4特异性
Fig.1SpecificitydetectionofprimerPcc1/ITS4

1～4. 4个柑橘黑斑病菌菌株; 5～8.4个首都叶点霉菌菌株;9～12.4个亚洲柑橘叶点霉菌菌株;13～16. 4个中国柑橘叶点霉菌菌株; 260 bp的条带为引物ACT512F/ACT783R扩增产物。

1-4. FourP.citricarpaisolates; 5-8.FourP.capitalensisisolates;9-12.FourP.citriasianaisolates ;13-16. FourP.citrichinaensisisolates; 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

图2引物Pc1/ITS4的特异性
Fig.2SpecificitydetectionofprimerPc1/ITS4

2.3引物的灵敏度检验

为了测试特异性引物Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的灵敏度，分别将中国柑橘叶点霉菌、柑橘黑斑病菌和首都叶点霉菌的基因组DNA进行梯度稀释，并对其进行PCR扩增。结果显示，当PCR体系中含有20 pg模板时，特异性引物Pcc1/ITS4能扩增出目的条带(图4-A)；虽然在模板含量为20 pg时，引物Pct4/ITS4能扩增出目的条带，但条带太弱，难以进行辨别，因此针对于首都叶点霉菌的特异性引物可检测到的模板最低量为200 pg(图4-B)；特异性引物Pc1/ITS4的检测灵敏度为 200 pg(图4-C)。证明所设计的特异性引物灵敏度较高，可用于病原菌的鉴定。

1～4.4个首都叶点霉菌菌株; 5～8.4个柑橘黑斑病菌菌株; 9～12.4个亚洲柑橘叶点霉菌菌株; 13～16.4个中国柑橘叶点霉菌菌株; 260 bp的条带为引物ACT512F/ACT783R扩增产物。

1-4. FourP.capitalensisisolates; 5-8. FourP.citricarpaisolates;9-12. FourP.citriasianaisolates; 13-16. FourP.citrichinaensisisolates; 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

图3引物Pct4/ITS4的特异性
Fig.3SpecificitydetectionofprimerPct4/ITS4

A.中国柑橘叶点霉菌特异性引物的灵敏度检验；B.首都叶点霉菌特异性引物的灵敏度检验；C.柑橘黑斑病菌特异性引物的灵敏度检验；M. Trans 2K plus DNA Marker；1～12.模板量为200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg、2 pg、200 fg、20 fg、2 fg、200 ag、20 ag和2 ag。

A. Sensitivity detection of specific primer forP.citrichinaensis; B. Sensitivity detection of specific primer forP.capitalensis; C.Sensitivity detection of specific primer forP.citricarpa; M. Trans 2K plus DNA Marker; 1-12. Nucleic acid template 200 ng, 20 ng, 2 ng, 200 pg, 20 pg, 2 pg, 200 fg,20 fg, 2 fg, 200 ag, 20 ag and 2 ag.

图4Pcc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pc1/ITS4引物的灵敏度检验
Fig.4SensitivitydetectionofspecificprimersPcc1/ITS4,Pct4/ITS4andPc1/ITS4

2.4果园疑似柑橘黑斑病病斑检测

引物Pc1/ITS4对甜橙具有疑似柑橘黑斑病症状的病斑和柚果、叶片具有疑似棕褐斑病症状的病斑基因组DNA检测结果显示，Pc1/ITS4从甜橙疑似柑橘黑斑病病斑基因组中扩增出柑橘黑斑病菌的目的条带，而不能从柚疑似棕褐斑病病斑基因组中扩增出任何条带(图5)。而特异性引物Pca8/ITS4仅可以从柚疑似棕褐斑病病斑中检测到亚洲柑橘叶点霉菌的目的条带。

1.阳性对照；2～4.具有疑似柚棕褐斑病症状的沙田柚果实病斑；5～7.具有疑似柚棕褐斑病症状的沙田柚叶片病斑；8～11.具有疑似柑橘黑斑病症状的甜橙果实病斑；M.100 bp Plus Ⅱ DNA Ladder.

1.Positive control; 2-4.Lesions from pomelo peel with doubtable tan spot symptoms; 5-7.Lesions from pomelo leaves with doubtable tan spot symptoms; 8-11.Lesions from fruit peel of sweet orange with suspected citrus black spot symptoms；M.100 bp Plus Ⅱ DNA Ladder.

图5特异性引物对柑橘叶片和果实疑似黑斑病症状病斑的检测
Fig.5Specificprimerdetectedthepathogenofcitrusfruitandleaflesionswithsuspectedblackspotsymptoms

3 结论与讨论

本研究设计并筛选了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的特异性引物，该特异性引物可以将柑橘上4种叶点霉属真菌进行区分，且设计的引物特异性好、灵敏度高，可用于柑橘黑斑病菌的快速检测。

利用本研究设计的特异性引物可以准确快速检测柑橘黑斑病菌，与前人研究相比，本研究将柑橘上存在的所有叶点霉菌(柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌、 中国柑橘叶点霉菌、亚洲柑橘叶点霉菌和巴西柑橘叶点霉菌)以及与中国柑橘叶点霉菌亲缘关系较近的舌下叶点霉菌进行序列比对，在ITS1和18S区域设计特异性引物，并将特异性引物对柑橘黑斑病菌、 首都叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌、亚洲柑橘叶点霉菌进行了扩增，特异性引物Pc1/ITS4只能从柑橘黑斑病菌中扩增出条带，而不能从中国柑橘上其他叶点霉属真菌和柑橘常见病害病原菌中扩增出条带。由于本研究中没有获得巴西柑橘叶点霉菌的菌株，所以特异性引物没有对巴西柑橘叶点霉菌进行扩增，下一步应从荷兰菌种保存中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，Utrecht，The Netherlands )或研究者Glienke获得巴西柑橘叶点霉菌菌株，并对所设计的引物进行检验。

前人设计的针对柑橘黑斑病菌的特异性引物灵敏度不同。Bonants等[10]设计的针对柑橘黑斑病菌的特异性引物GCF3/GCR7检测病原菌的灵敏度为20 pg；Meyer等[11]设计的特异性引物CITRIC1/ITS4检测柑橘黑斑病菌的灵敏度为100 pg；Peres等[13]设计的特异性引物GCN/GCMR检测病原菌的灵敏度为1 pg。而本研究设计的特异性引物Pc1/ITS4检测病原菌的灵敏度为200 pg，与前人研究相比灵敏度较低，但本研究设计的特异性引物能够将致病菌柑橘黑斑病菌与亚洲柑橘叶点霉菌、中国柑橘叶点霉菌区分，前人所设计的针对柑橘黑斑病菌的引物也能检测亚洲柑橘叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌，错误诊断率提高，影响柑橘的销售。

以本研究设计的特异性引物作为基础，再加上本实验室设计的针对亚洲柑橘叶点霉菌的特异性引物Pca8/ITS4[6]，再辅以杂交探针等技术，必定能够建立完善的致病菌柑橘黑斑病菌和亚洲柑橘叶点霉菌快速分子检测技术，防止柑橘黑斑病在我国和其他国家进一步蔓延。

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MolecularDetectionofPhyllostictacitricarpaonCitrusBlackSpot

WANG Xinghong1，2

(1.Chinese Academy of Forestry，Experimental Center of Forestry in North China，Beijing 102300，China;2.College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

In order to distinguishP.citricarpa，P.citriasiana,P.capitalensisandP.citrichinaensis，upstream primers forP.citricarpa，P.capitalensisandP.citrichinaensiswere designed in ITS1 and 18S regions，and these primers were used together with theITS4 primer.Then，the specificity and annealing temperature of primers were screened，and the sensitivity of the specific primers were verified.Screened primer was used to detectP.citricarpawhen DNA was extracted from black/tan spot lesions on fruits or leaves.The results showed that 593 bp specific fragments were only obtained fromP.citricarpaby specific primerPc1/ITS4，551 bp specific fragments were only obtained fromP.capitalensisby specific primerPct4/ITS4，and 706 bp specific fragments were only obtained fromP.citrichinaensisby specific primerPcc1/ITS4，when annealing temperature at 60 ℃.These specific primers were never amplified any fragment from the commonCitruspathogens.The sensitivity test results showed that the sensitivity of specific primersPc1/ITS4 andPct4/ITS4 was 200 pg，and the sensitivity of specific primerPcc1/ITS4 was 20 pg.The screened specific primerPc1/ITS4 could detectP.citricarpafrom DNA of black spot lesions on fruit.Therefore，using the specific primers，combined with the simple method of DNA extraction，the molecular detection for the pathogen ofCitrusblack spot could be completed in a short time.

Citrusblack spot;Phyllostictacitricarpa;Phyllostictacitrichinaensis;Phyllostictacapitalensis; Specific primers

2017-08-01

国家现代农业(柑橘)产业技术体系建设专项资金项目(CARS-27)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(CAFYBB2016QA013)

王兴红(1982-)，女，河北深州人，工程师，博士，主要从事植物病原真菌系统演化研究。

S436.66

A

1000-7091(2017)05-0130-06

10.7668/hbnxb.2017.05.020