响应面法优化桑葚酒渣中花色苷提取工艺研究

响应面法优化桑葚酒渣中花色苷提取工艺研究

胡彦新1，2，王英2，刘小莉2，董明盛1，周剑忠1，2，*
（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014）

为提高桑葚酒渣中花色苷的提取率，以花色苷提取率为考察目标，利用响应面分析法（RSM）对桑葚酒渣中花色苷的提取工艺进行优化，首先在单因素试验的基础上，对液料比、提取时间、提取温度、超声功率、加酶量和pH值这6个因素进行筛选，然后利用响应面法对加酶量、提取温度、提取时间进行优化。最终获得提取花色苷最佳的工艺条件为：加酶量0.2%、提取温度64℃、提取时间145 min。在此试验条件下花色苷的提取率为4.68 mg/g。

桑甚酒渣；花色苷；响应面法

桑葚又称桑堪，又名桑堪子、桑蔗、桑枣、桑果、乌堪等，为桑科落叶乔木桑树的成熟果穗，其化学成分复杂，营养丰富，成熟的桑葚果含有丰富的活性蛋白、维生素、氨基酸、胡萝卜素、矿物质、白藜芦醇、花青素等成分，其营养是葡萄的4倍、苹果的5倍～6倍，具有提高人体免疫力、延缓衰老、促进造血细胞生长、防止动脉硬化、促进新陈代谢等多种功能。

桑葚酒渣是桑葚在果汁桑葚酒酿造等加工过程中产生的废弃物，桑葚酒渣中含有大量的花色苷，花色苷作为一种天然色素，安全、无毒、资源丰富，且具有清除体内自由基、抗炎、抗癌、阻碍小肠对胆固醇和胆汁酸的吸收[1-5]、减轻肝机能障碍、抑制脂质过氧化和用于治疗糖尿病性视网膜病、抗突变、治疗乳房囊肿，治疗微循环疾病以及用于预防动脉粥样硬化等保健功能，现已被广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业[6-9]。

桑葚[10]酒渣中主要的活性成分是花色苷，在桑葚酒渣中含量丰富，为了节约时间、提高效率、简化工序，本试验探究了液料比、提取时间、提取温度、超声功率、加酶量和pH值这6个因素对花色苷提取率的影响的大小[11-16]。首先利用单因素试验对液料比、提取时间、提取温度、超声功率、加酶量和pH值这6个因素进行筛选，然后对加酶量、提取温度、提取时间这3个主要影响因素进行响应面法优化。最终得到提取桑葚酒渣中花色苷的最佳条件，为后期试验的顺利进行奠定下夯实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚酒渣为桑葚酒发酵完毕后的副产物，经冷冻干燥后备用。氯化钠、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸（均为国产分析纯）：湖南九典制药股份有限公司。

UV-5100分光光度计：上海美普达仪器有限公司；LC-210.2精密电子天平：德国赛多利斯股份有限公司产品；SevenEasy plus pH仪：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；THZ-C-1恒温振荡器：太仓市实验设备厂。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 桑葚酒渣中花色苷的提取

花色苷的提取采用超声波辅助果胶酶法提取[17]：将一定料液比的桑葚酒渣在自然状态下静置1 h，调节反应体系的pH值，随后加入果胶酶和纤维素酶0.3%（质量分数），超声一段时间，获得花色苷提取液。然后用旋转蒸发仪对上述所提取的花色苷提取液进行浓缩，除去多余的水分，得到浓度较高花色苷提取液。

1.2.2 花色苷含量的测定

花色苷含量测定采用pH示差法[18]。依据pH示差法的原理取0.025 mol/L（pH1.0）的氯化钾缓冲液和0.4 mol/L（pH 4.5）的乙酸钠缓冲液各5 mL分别加入1 mL的待测样品，混匀，室温下避光平衡30 min，用蒸馏水作空白，在矢车菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波长510 nm和700 nm（校正浑浊度）下，测定吸光度值，稀释样品的吸光度值以及原始样品中花色苷含量按如下公式计算：

式中：TAcy为桑葚花色苷含量，mg/g；V为提取液的总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量，449.2；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；A为样品的吸光度值；m为原料的质量，g。

1.2.3 单因素试验的设计

1.2.3.1 料液比对提取率的影响

在固定超声波功率400 W，pH 4.0、加酶量0.2%、提取温度50℃和提取时间90 min条件下，考察不同的料液比（1 ∶0.5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20 g/mL）对其提取率影响，确定最佳料液比。

1.2.3.2 提取时间对提取率的影响

在固定超声波功率400 W，pH 4.0、加酶量0.2%、提取温度50℃和料液比1∶15（g/mL）条件下，考察不同的提取时间（30、60、90、120、150 min）对其提取率影响，确定最佳提取时间。

1.2.3.3 提取温度对提取率的影响

在固定pH 4.0、加酶量0.2%、超声波功率400 W、料液比1∶15（g/mL）和提取时间90 min条件下，考察不同的提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对其提取率影响，确定最佳提取温度。

1.2.3.4 加酶量对提取率的影响

在固定超声波功率400W，pH4.0、料液比1∶15 g/mL、提取温度50℃和提取时间90 min条件下，测定不同的加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对其提取率影响，确定最佳加酶量。

1.2.3.5 超声波功率对提取率的影响

在固定加酶量 0.2%，pH 4.0、料液比 1 ∶15（g/mL）、提取温度50℃和提取时间90 min条件下，测定不同的超声波功率（100、200、300、400、500 W）对其提取率影响，确定最佳超声波功率。

1.2.3.6 pH值对提取率的影响

固定加酶量0.2%、料液比1∶15（g/mL）、超声波功率400 W、提取温度50℃和提取时间90 min条件下，测定不同的 pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0） 对其提取率影响，确定最佳pH值。

1.2.4 响应面试验设计

在固定料液比1∶15（g/mL）、超声波功率300 W、pH 4.0等条件的前提下，选取加酶量、提取温度和提取时间3个因素为自变量，以每克桑葚酒渣中提得的花色苷毫克数为指标，进行Box-Behnken试验，试验因素水平及编码见表1。

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of central composite design

1.2.5 数据处理

采用SAS 8.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比的影响

料液比的不同对花色苷提取的影响见图1。

图1 不同料液比对花色苷提取的影响Fig.1 Influence of difference solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanin

由图 1可知，在料液比低于 1∶15（g/mL）时，随着料液比的不断增大，花色苷提取率增大的趋势较快。当料液比为1∶15（g/mL）时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.26 mg/g，当继续增大料液比时，花色苷的提取率增加的趋势逐渐变缓，并且最终趋于平稳，考虑料液比过大，反应体系较浓稠，不利于花色苷的溶出以及造成试验材料的浪费，料液比为1 ∶15（g/mL）较适宜。

2.1.2 提取时间的影响

不同提取时间对花色苷提取的影响见图2。

图2 不同提取时间对花色苷提取的影响Fig.2 Influence of difference extraction time on the extraction of anthocyanin

由图2可知，在提取时间低于120 min时，随着提取时间的延长，花色苷提取率增大的趋势较快。当提取时间为120 min时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.58 mg/g，当继续延长提取时间时，花色苷的提取率增加的趋势逐渐变缓，并且最终趋于平稳，并且时间延长会导致更多的花色苷发生氧化而损失[19-21]。因此，综合试验周期考虑，本试验将提取时间确定为120 min。

2.1.3 提取温度的影响

不同提取温度对花色苷提取的影响见图3。

图3 不同提取温度取对花色苷提取的影响Fig.3 Influence of difference extraction temperature on the extraction of anthocyanin

由图3可知，在提取温度低于60℃时，随着提取温度的升高，花色苷提取率增大的趋势较快。当提取温度为60℃时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.52 mg/g，继续升高温度，提取率反而下降，这是由于花色苷物质耐热性较差[22-23]，并且在高温状态下果胶酶和纤维素酶也容易失活，因此本试验将提取温度确定为60℃。

2.1.4 加酶量的影响

不同加酶量对花色苷提取的影响见图4。

图4 不同加酶量对花色苷提取的影响Fig.4 Influence of difference enzyme dosage on the extraction of anthocyanin

如图4所示，在加酶量低于0.2%时，随着加酶量的增加，花色苷提取率增大的趋势较快。当加酶量为0.2%时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.56 mg/g，当继续增加加酶量时，花色苷的提取率增加的趋势逐渐变缓，并且最终趋于平稳。

2.1.5 超声波功率的影响

不同超声功率对花色苷提取的影响见图5。

由图5可知，在超声功率低于300 W时，随着超声功率的升高，花色苷提取率增大的趋势较快。当超声功率为300 W时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.52 mg/g，继续升高超声功率，提取率反而下降，因此本试验将超声功率设定为300 W。

图5 不同超声功率对花色苷提取的影响Fig.5 Influence of difference ultrasonic power on the extraction of anthocyanin

2.1.6 pH值的影响

不同pH值对花色苷提取的影响见图6。

图6 不同pH值对花色苷提取的影响Fig.6 Influence of difference pH on the extraction of anthocyanin

由图6可知，在pH低于4.0时，随着pH值的升高，花色苷提取率呈现增大的趋势。当pH值为4.0时，花色苷提取的提取率已经达到相对比较大的数值4.82 mg/g，继续升pH值，提取率反而下降，这可能是因为在较高的pH值条件下果胶酶和纤维素酶部分失活造成的[24]，因此本试验将pH值确定为4.0。

2.2 响应面法优化桑葚酒渣花色苷提取工艺

2.2.1 响应面模型的建立及其方差分析

虽然影响桑葚酒渣中花色苷提取率的因素很多，但加酶量、提取温度和提取时间是影响其提取率的最主要的因素，通过方差分析，这3个因素对花色苷提取率影响显著（P<0.05），故对这3个关键因素进行响应面优化。

采用Box-Behnken试验设计及结果见表2，利用Design Expert8.0.6对其进行多元回归拟合，获得响应值花色苷提取率（Y）对自变量 X1、X2、X3的二次多项式回归方程

上述回归模型进行方差分析，结果见表3，结果表明，模型是极显著的（P=0.000 1）失拟项不显著（P=0.071 7），回归模型的决定系数为0.966 1，说明该模型能解释96.61%的变化，该模型拟合程度良好，试验误差小，用该模型对桑葚酒渣花色苷提取工艺进行优化可以获得良好的效果。

表2 响应面设计及结果Table 2 Design and results of response surface tests

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

模型回归系数显著性分析见表4。

表4 回归方程系数显著性检验表Table 4 Significance test for regression coefficients

由回归方程系数显著性检验可知；模型一次项X1、X2、X3极显著（P＜0.01），二次项不显著，交叉项X1X3、X1X2、X2X3极显著（p＜0.01）。将二次回归方程中一次项系数绝对值大小作为各参数对花色苷提取率影响的比较依据[25]，得出三因素对花色苷提取率影响的大小依次为：X3＞X1＞X2，即提取时间、加酶量和提取温度。

2.2.2 响应面分析的结果

响应面分析的结果见图7。

图7 响应面图Fig.7 Response surface

通过二次多项式回归方程所得到的响应面如图7，可知 X1X2、X1X3、X2X3对桑葚酒渣花色苷提取率的影响极显著（p＜0.01），由图7可知，当提取时间为120 min时，在加酶量0.15%～0.25%，提取温度55℃～65℃时桑葚酒渣中花色苷提取量达到最大；当提取温度为60℃时，在加酶量0.15%～0.25%，提取时间110 min～130 min时桑葚酒渣中花色苷提取量达到最大；当加酶量为0.2%时，在提取温度55℃～65℃，提取时间110min～130min时桑葚酒渣中花色苷提取量达到最大。

2.3 模型的验证

当将加酶量、提取温度、提取时间的取值范围分别设为 0.1%～0.3%、50℃～70℃、90 min～150 min，并将目标值即花色苷的提取效率设定为最大值，通过Design-Expert 8.0.6软件获得最优组合为加酶量0.2%、提取温度63.95℃、提取时间143.67 min。在此最优组合下，理论最佳桑葚酒渣花色苷的提取率为4.77 mg/g。根据实际条件的限制将最优组合修正为：加酶量0.2%、提取温度64℃、提取时间145 min，在此试验条件下桑葚酒渣花色苷的提取率为4.68 mg/g。与预测值相差不大，说明响应面法对提取桑葚酒渣花色苷条件的优化是可行的。

3 结论

本试验是以花色苷提取率为考察目标，利用响应面分析法（RSM）对桑葚酒渣中花色苷的提取工艺进行优化，首先利用单因素试验对液料比、提取时间、提取温度、超声功率、加酶量和pH值这6个因素进行筛选，然后利用响应面法优化加酶量、提取温度、提取时间。最终获得提取花色苷最佳的工艺条件为：加酶量0.2%、提取温度64℃、提取时间145 min。在此试验条件下花色苷的提取率为4.68 mg/g。因此，利用响应面分析方法对桑葚酒渣花色苷提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，该试验是可行的。

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The Research on the Optimization of Anthocyanin Extraction in Mulberry Wine Residue by Response Surface

HU Yan-xin1，2，WANG Ying2，LIU Xiao-li2，DONG Ming-sheng1，ZHOU Jian-zhong1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，Jiangsu，China 2.The Research Institute of Agricultural Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

In order to improve the extraction efficiency of anthocyanin in the mulberry wine residue，the optimization of anthocyanin extraction in the mulberry wine residue were studied by the response surface methodology （RSM）.On the basis of one-factor test，six factors including solid-liquid ratio，extraction time，extraction temperature，ultrasonic power，enzyme quantity and pH value were screened.Afterwards，the enzyme quantity，extraction time and extraction temperature were optimized by response surface methodology.The optimum conditions of anthocyanin extraction mulberry wine residue were as follow：volume of enzyme 0.2%，the extraction temperature 64℃，the extraction duration 145 min.At this condition，the extraction yield of anthocyanin was 4.68 mg/g.

mulberry wine residue；anthocyanin；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.010

江苏省农业科技自主创新项目（CX(14)2118）

胡彦新（1990—），男（汉），硕士在读，研究方向：食品微生物。

*通信作者：周剑忠（1965—），男，研究员，博士，研究方向：食品生物技术。

2017-02-21