CART-19在血液恶性肿瘤治疗中的临床应用

吴 利(综述)，罗玉萍(审校)

(南昌大学a.研究生院2016级； b.生命科学学院遗传教研室，南昌 330031)

CART-19在血液恶性肿瘤治疗中的临床应用

吴 利a(综述)，罗玉萍b(审校)

(南昌大学a.研究生院2016级； b.生命科学学院遗传教研室，南昌 330031)

嵌合型抗原受体基因修饰的T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)免疫疗法是通过基因工程方法改造宿主T细胞，使其能自主靶向结合并杀死肿瘤细胞的治疗方法。该疗法临床研究最多的是CART-19，其是以B细胞表面特异性蛋白CD19为靶抗原的CART细胞，主要用于治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B细胞系肿瘤。文章就CART-19在血液恶性肿瘤中治疗的临床应用进展作一综述。

嵌合型抗原受体基因修饰的T细胞-19； 血液恶性肿瘤； 治疗； 临床应用

随着肿瘤免疫疗法的兴起，嵌合型抗原受体基因修饰的T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)技术迅速发展，成为肿瘤免疫治疗的新手段之一。CART技术是通过基因工程方法将人工构建的特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)导入T淋巴细胞，使其能在不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制下,特异性识别并杀死表达相关抗原的肿瘤细胞。由于肿瘤表面抗原具有多样性，寻找合适的靶抗原一直都是CART治疗的关键环节之一[1]。CD19是B细胞特异性表面蛋白，其表达几乎贯穿B细胞发育的整个过程[2]，且由CART-19治疗引起的B细胞缺乏症临床上可通过补充丙种球蛋白来缓解，因此，CD19成为CART技术治疗B细胞系肿瘤的一个潜在的理想靶点[3-4]。笔者就CART-19在血液恶性肿瘤中治疗的临床应用作一综述。

1 CART技术原理

CART技术是将抗体抗原的高亲和性与T淋巴细胞的杀伤机制相结合来发挥疗效的，其原理是：先将能够识别肿瘤相关抗原的单链抗体(single chain variable fragments，scFv)与T细胞受体的亚基(T cell receptor，TCR)相结合，再通过基因工程方法导入宿主T细胞,使其表面产生特殊受体——CAR。用基因工程方法修饰后的CART细胞能够特异性地识别肿瘤细胞，在与目的抗原结合后直接介导细胞毒性，通过释放一些细胞因子(如穿孔素、颗粒酶、干扰素和肿瘤坏死因子等)攻击肿瘤细胞。

2 CAR结构发展

1989年，Gross等科学家首次用小鼠细胞成功构建和表达了CAR。经过二十多年的研究和探索，CAR结构已经从第1代发展到了第4代[1]。CAR的基础结构包括肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)结合区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。第1代CAR介导的T细胞激活是通过CD3z链或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成。虽能成功识别靶抗原，但缺乏协同共刺激分子，而不能被充分激活，其增殖能力和细胞因子分泌能力都很低下，难以维持有效的杀瘤效果。第2代CAR在胞内信号区添加了1个协同刺激分子(如CD28、CD134等)，实现了T细胞的双重活化，大大提高了因子释放和T细胞增殖能力，从而增强了CART细胞的杀瘤活性[5]。有研究[6]发现，在胞内信号区域整合2个协同刺激分子，T细胞的活化和杀瘤效应明显优于1个协同刺激分子的CAR，于是产生了第3代CAR(如同时整合CD28、OX40-f和CD28、4-1BB-f)。第4代CAR是在第3代CAR结构的基础上，增加了编码CAR及其启动子的载体，使CART细胞能更有效分泌细胞因子和表达细胞表面受体，改善体内杀瘤的微环境。目前，第3、4代CART细胞在临床应用中还比较少，其安全性和有效性是否优于第2代CART细胞也尚无定论。临床上使用的多为第2代CAR。

3 CART-19在血液恶性肿瘤治疗中的临床应用

CART-19的靶抗原为B细胞表面特异性表达的CD19蛋白，主要应用于B细胞系肿瘤的靶向治疗，包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B细胞淋巴瘤。有文献[7]报道，CART-19治疗血液肿瘤的总反应率为73%，其中ALL的平均反应率(93%)明显高于CLL(62%)和B细胞淋巴瘤(36%)。Kochenderfer等[8]首次报道了CART-19免疫疗法成功用于治疗复发难治滤泡性淋巴瘤(follicular Lymphoma，FL)，患者获得完全缓解(CR)至少6个月。Brentjens等[9]报道，对2例复发性难治性B-ALL和8例复发性难治性B-CLL采用CART-19治疗，不仅证明了CART-19的有效性，且提出在治疗前进行环磷酰胺预处理和输注适当的CART细胞数，对疗效有重要的作用，同时5例复发性难治性B-ALL患者经2年随访，发现治疗前采用环磷酰胺化疗预清除体内肿瘤细胞能够减少治疗后的不良反应。有研究[10]指出，在控制因子风暴时所使用的类固醇药物会降低CART-19的杀伤效率，导致复发。Grupp等[11]采用CART-19治疗2例复发性难治性B-ALL患儿均获得CR，其中1例2个月后出现CD19阴性复发，提示B细胞肿瘤在CART-19持续、有效的过程中仍有可能通过逃逸机制复发。Maude等[12]报道，采用CART-19治疗30例复发性难治性B-ALL患者，结果显示，CR率高达90%，其中无进展生存期超过6个月的患者率达67%，说明CART-19在临床应用中有无限潜力。Kochenderfer等[13]报道，采用CART-19治疗9例弥漫性大B细胞性淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，其中有4例达CR，且最长CR持续时间为22个月。韩为东等[14]报道，采用CART-19治疗9例B-ALL患者，总反应率为67%。李萍等[15]报道，采用CART-19治疗18例复发难治性白血病/淋巴瘤患者，结果显示，总有效率达61.1%，其中6例达到CR。Garfall等[16]报道，采用CART-19免疫疗法、化疗联合自体干细胞移植治疗1例晚期多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者，其疗效为CR，且CR持续时间长达12个月以上，说明CART-19(因为肿瘤浆细胞中CD19的表达量非常低，仅有0.05%)在整个治疗中发挥了至关重要的作用，这一成果给科学家们提供了更多的思考空间。

4 CART-19在血液恶性肿瘤治疗中出现的问题

CART-19在血液恶性肿瘤的临床研究中已取得令人瞩目的进展，但在其真正的广泛应用于临床治疗之前，还有很多与安全性、有效性相关的问题有待于解决[17-18]。

4.1脱靶效应

免疫反应介导的表达靶抗原的正常组织排斥反应被称为脱靶效应，脱靶效应表现最明显的是靶向CD19[15,19]。CART-19细胞不仅会结合和杀伤靶向的CD19阳性的肿瘤B细胞，同时也会清除体内健康成熟的B细胞，从而引起机体损伤。针对这种情况，有学者[3]提出可通过增加靶抗原数目来提高CART细胞的特异性，如CD22在B-ALL细胞上有高表达，可考虑同时靶向CD19和CD22来提高CART细胞的特异性，减少脱靶效应。

4.2不良反应

有文献[15,18,20]报道，CART-19治疗的不良反应主要包括肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴、巨噬细胞综合征、神经毒性、B细胞缺失等。临床症状轻者仅类似感冒，重者则可发生多脏器功能衰竭，甚至死亡。目前，有研究[21-22]认为CART-19引起的不良反应主要是由于治疗后大量释放细胞因子——白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2受体(IL-2R)等引起的。临床上一般采用类固醇激素和IL-6受体抗体阻断剂(如托珠单抗注射液)药物来缓解细胞因子风暴，以及输注丙种球蛋白等方法来控制上述不良反应。同时，治疗前采用注射用磷酸氟达拉滨联合注射用环磷酰胺预处理来降低体内肿瘤负荷，以及根据患者的体质量来优化每次输入CART-19细胞数量，从而有效减少不良反应的发生[9,15]。但是，由于患者治疗后的个体差异性，上述方法有时也无法及时、有效地控制不良反应，导致病情恶化。

4.3复发问题

CART-19免疫疗法的复发主要有CD19阳性肿瘤复发和CAR靶点丢失型肿瘤复发。前者主要是由于CART-19细胞无法在患者体内持续存活和持续、有效杀瘤而引起的[4]。针对这一情况，有学者[4,23]发现可通过整合4-1BB共刺激分子和提高CART细胞中心记忆T细胞的比例来提高其在体内的疗效。另外，所有临床研究应用的CART-19细胞均是采用鼠源的单链可变区(scFv)，这可能是患者体内CART细胞丢失的原因之一。但将鼠源的scFv换成人源scFv来减少CART的免疫原性，也有可能增加CAR在体内的持续性。

CAR靶点丢失型肿瘤复发主要是因肿瘤细胞长期处于生存压力下而产生免疫逃逸引起的。其复发主要有两种情况：1)靶分子在保留必要功能区段的情况下丢失CART-19靶向区段。2)靶分子表达CD19阴性克隆。对此，科学家们正在研究设计靶向更保守区段的CAR分子或增加靶点，如同时靶向CD19和CD22、CD20等来防止此类逃逸性复发[4]。

4.4插入性突变

CART-19细胞制备大多是以慢病毒或逆转录病毒为载体，将CAR导入宿主T细胞，从而将外源基因片段引入患者体内。除了起到积极的治疗作用外，也可能会引起有害的插入性突变。目前，针对该问题研究较多的是利用mRNA电转制备短期效应的CART-19细胞或引入自杀基因系统共同修饰T细胞，如单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)、化学诱导二聚化/半胱天冬酶9(CID/casp9)等[20]。当肿瘤细胞被完全清除时，可诱导启动自杀基因，从而避免CART-19细胞在患者体内永生化，甚至产生新的肿瘤。

5 展望

CART-19细胞疗法的出现给血液恶性肿瘤患者带来了更多的生存希望，该疗法在ALL等早期临床试验中成效显著。但CART-19的临床研究还处于起始阶段，如何提高疗效和有效控制治疗后的不良反应、提高生存率仍是研究的重点和难点。同时，由于目前的CART-19细胞是用患者自身T细胞制备的，且治疗方案也需要根据患者的具体病情来决定，从而大大增加了治疗的不确定性。同时，这也是目前CART治疗成本高、规模有限的主要原因。因此，如果能降低成本、扩大制备规模和制备通用型CART细胞，这必将为更多的患者带来福音。

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(责任编辑：胡炜华)

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