白藜芦醇经鼻腔黏膜给药脑内释药特性的研究

李跃东,崔京浩,罗道奇

(1.苏州市第七人民医院·苏州大学附属第二医院高新区医院药剂科;2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215151)

白藜芦醇经鼻腔黏膜给药脑内释药特性的研究

李跃东1,崔京浩2,罗道奇2

(1.苏州市第七人民医院·苏州大学附属第二医院高新区医院药剂科;2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215151)

目的通过鼻腔灌流给药与静脉给药两种方式来考察白藜芦醇包合以后，经鼻入脑释药的可能性。方法取新西兰兔3只，体质量约为3 kg，分别经鼻腔灌流与静脉注射白藜芦醇羟丙基-β-环糊精包合物，观察单位质量血液、大脑、嗅脑及筛鼻甲中白藜芦醇的分布情况。结果静脉给药后，单位质量组织中白藜芦醇的含量从高到低依次为血液、大脑、嗅脑和筛鼻甲，分别为(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.0297±0.0129)μg/g；鼻腔灌流后，单位质量组织中白藜芦醇的含量从高到低依次为筛鼻甲、嗅脑、血液和大脑，分别为(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，单位质量筛鼻甲及嗅脑中白藜芦醇含量均明显高于静脉给药后(P<0.05或P<0.01)。结论经鼻腔灌流给药可以改善白藜芦醇在筛鼻甲和嗅脑中的分布，从而发挥脑内释药的作用。

白藜芦醇;鼻腔灌流;脑内释药;羟丙基-β-环糊精

白藜芦醇是从植物中提取的天然化学物质，是一种常见的二苯乙烯类化4合物，其化学结构名称为3,4’,5-三羟基二苯乙烯，又名芪三酚，分子式为C14H12O3。现代药理学研究[1-3]表明，白藜芦醇不仅具有保护心血管、调节血脂代谢、保护神经及抗炎等多种生理活性，还具有抗氧化、抗自由基、延年益寿、提高免疫系统活性的作用。目前，白藜芦醇在日本、美国、加拿大等国家已被广泛接受，但由于国内白藜芦醇研究起步较晚，对其功能认识尚存在一定不足。关于白藜芦醇，已研究的制剂主要包括纳米粒、脂质体、胶囊剂和保健品，但因其水不溶性的特点使普通制剂难以通过口服给药途径在体内发挥良好的生物活性[4-5]。因此，为避免白藜芦醇的首过效应，提高生物利用度，本实验拟将白藜芦醇制备成鼻腔给药制剂，以初步探讨其鼻腔黏膜给药脑内释药的特性。

1 材料与方法

1.1一般材料

实验动物：新西兰兔3只，体质量约为3 kg，由苏州大学动物实验中心提供。试剂：白藜芦醇(批号：ZL01302008，纯度>98%，南京泽朗医药科技有限公司)；甲醇(批号：10071753，色谱纯，美国斯百全公司)；羟丙基-β-环糊精(批号：100301，纯度≥98%，上海睿腾化工有限公司)；无水乙醇(批号：20120403，江苏强盛功能化学股份有限公司)。仪器：高效液相色谱(LC-15C型泵，SPD-15C型检测器，日本岛津公司)； X-射线衍射仪(X’Pert-Pro MPD，荷兰帕纳科公司)；红外分光光度计(Pro Star LC240，美国瓦里安公司)；紫外分光光度计(UV-2600型，日本岛津公司)。

白藜芦醇与羟丙基-β-环糊精包合物采用冷冻干燥法进行制备，首先取适量羟丙基-β-环糊精于干净烧杯中，加水置磁力搅拌器上搅拌至溶解，取处方量白藜芦醇于试管中，加乙醇溶解，滴加至上述烧杯中继续避光搅拌1.5 h；待包合完成，将包合物溶液置于冰箱，预冻、真空冷冻干燥，即得白藜芦醇环糊精分子包合物。

1.2方法

1.2.1 实验动物模型与实验装置 兔耳缘静脉注射10%水合氯醛(2 mL·kg-1)麻醉，仰卧、固定四肢及头部后，于手术台上进行手术；切开颈部皮肤，暴露气管和食管，气管切开后插入聚乙烯管，以保证正常呼吸；另取一根细聚乙烯管通过气管插至鼻腔后部，用胶黏剂将鼻腭至口腔的通道封闭，以防止药液从鼻腔流入口腔中，同时从两根聚乙烯管中间结扎气管和食管；用聚乙烯管连接蠕动泵，将盛有药液的容器置于37 ℃恒温水浴器中，封住瓶口，防止水分蒸发；用蠕动泵将药液以恒定的速度泵入鼻腔，并从两侧鼻孔流出，定时取样以测定灌流液中的药物浓度，确定药物吸收量[6-7]。

1.2.2 鼻腔灌流液取样及测定 先以10 mL生理盐水灌流10 min，测定灌流前后生理盐水体积，若灌流液体积变化<0.1 mL，则整个灌流环路密封性良好，没有漏液。待兔鼻腔灌流适应后，排尽所有生理盐水。取8 mL白藜芦醇包合物酚红生理盐水溶液于密封的量筒中，置于37 ℃水浴恒温。将蠕动泵进液管插入量筒底部，启动蠕动泵，流速为1.0 mL/min，待兔鼻中药液滴出时开始计时，分别于0、5、10、15、20、30、45、60 min读取量筒中剩余白藜芦醇药液的体积Vn后取样0.1 mL，补加空白生理盐水0.1 mL，以高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定各时间点剩余白藜芦醇的质量浓度Cn，通过不同时间计算剩余白藜芦醇的量Qn。剩余白藜芦醇的量Qn计算方法：Qn=V实际Cn，该公式中Qn为第n个时间点的剩余白藜芦醇的量(μg)，V实际为鼻腔灌流液的实际体积=酚红总量/酚红实时浓度[8]。

1.2.3 生物样品取样及测定 兔鼻腔灌流60 min后，自心脏取血约0.5 mL，以10 000 rpm离心10 min，取上清液0.2 mL，置于1.5 mL离心管中，加浓度为40.5 μg/mL内标物根皮素20 μL，涡旋混匀；加乙酸乙酯1 mL后，再涡旋3 min，以10 000 rpm离心10 min，取上清液800 μL，氮气吹干，加80 μL甲醇复溶后，HPLC分析。

取血完毕后，处死新西兰兔，取出大脑、嗅脑和筛鼻甲，称重，分别加入2 mL生理盐水和20 μL浓度为40.5 μg/mL的根皮素，涡旋振荡混匀后，匀浆。上述各个样品中加入2 mL乙酸乙酯，涡旋振荡3 min，以10 000 rpm离心10 min。取1.4 mL上清液，氮气吹干，加甲醇80 μL复溶后，HPLC分析[9]。

1.2.4 静脉给药 兔耳缘静脉注射2 mL环糊精包合物溶液(剂量同灌流液)，60 min后，从心脏取血，血液静置30 min，10 000 rpm离心10 min，取上清液0.2 mL，加入20 μL浓度为40.5 μg/mL的根皮素(内标物)；涡旋振荡均匀后，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋振荡3 min萃取，10 000 rpm离心10 min，取上清液0.8 mL，于通风橱中氮气流吹干，加甲醇80 μL复溶；涡旋震荡均匀后，10 000 rpm离心10 min，取上清液20 μL，行HPLC分析。

取血完毕后，处死新西兰兔，取出大脑、嗅脑、筛鼻甲，大脑称取0.5 g，取称重好的大脑和全部嗅脑，分别加入2 mL生理盐水和20 μL浓度为40.5 μg/mL的根皮素(内标物)，涡旋振荡均匀后，匀浆；筛鼻甲加入2 mL生理盐水于研钵中研匀，各个样品加乙酸乙酯2 mL，涡旋振荡3 min萃取，每个样品离心(10 000 rpm 10 min)，取上清液1.4 mL，于通风橱中氮气流吹干，加甲醇80 μL复溶；涡旋震荡均匀后，离心(10 000 rpm 10 min)，取上清液20 μL，行HPLC分析。

1.3统计学分析

2 结果

2.1鼻腔灌流后白藜芦醇的吸收量

每只兔的鼻腔灌流白藜芦醇量为5 369.99 μg，鼻腔灌流60 min后白藜芦醇平均吸收量为(941.66±428.64)μg，吸收百分比为(17.54±7.94)%。见表1。

表1 鼻腔灌流60 min后白藜芦醇的吸收量

2.2静脉给药后单位质量组织中白藜芦醇的量

每只兔的静脉给药量为5 369.99 μg，与鼻腔灌流量相同。静脉给药60 min后，单位质量组织中白藜芦醇的含量从高到低依次为血液、大脑、嗅脑和筛鼻甲，分别为(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.029 7±0.012 9)μg/g。见表2。

表2 静脉给药后单位质量组织中白藜芦醇的量(A)及白藜芦醇在各组织中的含量(C)

2.3鼻腔灌流后单位质量组织中白藜芦醇的量

鼻腔灌流60 min后，单位质量组织中白藜芦醇的含量从高到低依次为筛鼻甲、嗅脑、血液和大脑，分别为(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，单位质量筛鼻甲及嗅脑中白藜芦醇含量均明显高于静脉给药后(P<0.05或P<0.01)，且大脑、血液中的含量几乎相当，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 鼻腔灌流后单位质量组织中白藜芦醇的量(A)及白藜芦醇在各组织中的含量(C)

3 讨论

本实验选择新西兰兔作为研究对象，主要考虑与大鼠麻醉易死和插管灌流手术要求较高不易操作有关。

由于白藜芦醇水饱和液溶解度较低，水中溶解度仅为40 μg/mL左右，鼻腔吸收量有限，通过简单实验验证，在此实验条件下几乎没有信号响应[10]。因此，本实验使用羟丙基-β-环糊精对白藜芦醇进行包合，以提高白藜芦醇在水中的溶解度；通过兔鼻腔灌流给药与静脉给药两种方式来考察白藜芦醇包合以后，经鼻入脑释药的可能性，旨在为全面系统地评价白藜芦醇鼻腔给药提供理论依据。

经鼻直接入脑的途径主要为筛鼻甲-嗅神经通路、嗅黏膜上皮通路-嗅脑-大脑。本实验结果表明，白藜芦醇静脉给药和鼻腔灌流给药均能进入脑部，且大脑中的含量几乎相当；鼻腔灌流后，单位质量筛鼻甲中白藜芦醇平均含量远大于静脉给药后，且嗅脑中的白藜芦醇平均含量亦明显大于静脉给药后，说明白藜芦醇的含量依次为筛鼻甲>嗅脑>大脑，尤其嗅脑白藜芦醇含量大于大脑，进一步证明白藜芦醇经鼻入脑通路的存在，提示经兔鼻腔灌流给药可以改善白藜芦醇在筛鼻甲和嗅脑中的分布，白藜芦醇经鼻腔黏膜给药后达到脑内释药是可行的。通过简单的验证实验，增加白藜芦醇静脉给药的量，会使进入脑部的白藜芦醇含量增加，这可能与白藜芦醇脂溶性较强，易透过血脑屏障有关[11-12]。但增加白藜芦醇包合物的鼻腔灌流量，进入脑部的白藜芦醇含量却没有静脉给药增加的明显；稍微减少白藜芦醇鼻腔灌流量，进入脑部的白藜芦醇含量亦未见明显减少，这可能与鼻腔吸收有饱和性有关[13-14]。

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Studyonthebrainreleasecharacteristicsofresveratrolthroughintranasaladministration

LI Yue-dong1,CUI Jing-hao2,LUO Dao-qi2

(1.DepartmentofPharmacy,TheSeventhPeople’sHospitalofSuzhou,GaoxinDistrictHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity;2.CollegeofPharmacy,SoochowUniversity,Suzhou215151,Jiangsu,China)

Objective：To explore the possibility of resveratrol into the brain via the nose after clathration through nasal perfusion and intravenous injection.Methods3 New Zealand rabbits with 3 kg of body weight approximately were selected,and resveratrol-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compounds were given respectively by nasal perfusion and intravenous injection.The distribution of resveratrol in blood,brain,rhinencephalon and sieve turbinate per unit mass was observed.ResultsAfter intravenous injection,the content of resveratrol in blood per unit mass was the highest,then was the brain,rhinencephalon and sieve turbinate,and the contents were (0.143±0.181)μg/g,(0.0357±0.0348)μg/g,(0.0313±0.0376)μg/g and (0.0297±0.0129)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the content of resveratrol in the sieve turbinate per unit mass was the highest,then was the rhinencephalon,blood and brain,and the contents were (149.529±2.344)μg/g,(0.124±0.072)μg/g,(0.097±0.104)μg/g and (0.025±0.019)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the contents of resveratrol in the sieve turbinate and rhinencephalon were significantly higher than those after intravenous injection (P<0.05 orP<0.01).ConclusionNasal perfusion of resveratrol can improve its distribution in the sieve turbinate and rhinencephalon so as to exert the effect of specific delivery in the brain.

Resveratrol;Nasal perfusion;Brain release;Hydroxypropyl-β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.037

2017-04-11

李跃东(1985-)，男，主管药师。E-mail:1344050208@qq.com

时间： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.076.html

1005-3697(2017)05-0778-04

R944.9

A

(学术编辑李毅)

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