HSP60与高脂饮食诱导的小鼠骨骼肌内质网应激的相关性研究

●李妍 罗玥佶 汤婷

HSP60与高脂饮食诱导的小鼠骨骼肌内质网应激的相关性研究

●李妍 罗玥佶 汤婷

目的：探讨热激蛋白60在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠骨骼肌内质网应激的表达机制。方法：4周龄C57BL/6J小鼠随机分组为正常和高脂饮食组。高脂饮食组给予高脂饮食16周，建立胰岛素抵抗小鼠模型。采用Western blot方法检测HSP60及内质网应激因子CHOP等蛋白表达。结果：与正常饮食组比较，高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠体重明显增加，葡萄糖耐量降低。骨骼肌中HSP60、CHOP、ClpP表达显著性升高（P＜0.05）。结论：高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠骨骼肌中HSP60表达水平升高，这可能与内质网应激发生有关。

HSP60；内质网应激；高脂饮食；胰岛素抵抗

热休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)是一种高水平基础表达的蛋白之一，作为一种分子伴侣，参与蛋白质折叠、装配及成熟过程。近年来研究发现，细胞受到刺激后HSP60蛋白表达量明显提高。在糖尿病患者血清中HSP60水平有显著改变，可能是一个与炎症反应相关、参与糖尿病发生发展的潜在因素。内质网（Endoplasmic reticulum, ER）是真核细胞内重要的膜性结构细胞器。在内质网应激诱导的细胞凋亡中，线粒体的改变也扮演着重要角色，即线粒体与内质网应激细胞的凋亡之间存在密切关系。本研究探讨热激蛋白60在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠骨骼肌内质网应激的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

SPF级C57BL/6J雄性小鼠4周龄14只，购自湖南斯莱克实验动物有限公司。小鼠编号后，适应喂养3天后随机分为两组，对照组7只喂养正常饲料（NC），高脂组7只喂养高脂饲料（HFD）。每周统计体重，喂养16周肥胖模型建立成功后处死小鼠，收集组织标本。

1.2 葡萄糖耐量试验（GTT）

小鼠禁食12h，断尾取血测血糖值，按体重2mg/g行50%葡萄糖注射，于15、30、60、90、120分钟分别测血糖。

1.3 免疫印迹检测

提取肌肉组织总蛋白，BAC法检测蛋白浓度，取蛋白质样品10ug，经SDS－PAGE凝胶电泳分离，并转膜，经与一抗HSP60、CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u和二抗温育，发光试剂ECL显色。以目的蛋白与相应内参条带吸光度比值作为目蛋白相对表达量。选择GAPDH为内参照。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s ）表示。两两比较采用t-检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食增加小鼠体重、降低葡萄糖耐量

与正常组比较，高脂饮食组小鼠在16周喂养后体重明显上升，有显著统计学差异（P＜0.05）。见表1。50%葡萄糖注射行葡萄糖耐量试验，15、30、60、120分钟测血糖，HFD小鼠血糖水平明显升高，糖耐量明显减退，差别有统计学意义（P＜0.05），见表2。高脂饮食诱导、胰岛素抵抗动物模型建立成功。

表1 高脂饮食对小鼠体重的影响（g）

表1 高脂饮食对小鼠体重的影响（g）

喂养周数分组 4 8 12 14 16正常组 23.8±0.6127.75±0.9329.51±1.2229.45±1.99 30.09±2.5高脂组 25.32±1.0932.36±1.3739.04±0.9740.66±2.2142.28±2.17

表2 高脂饮食对小鼠葡萄糖耐量影响（mmol·L-1）

表2 高脂饮食对小鼠葡萄糖耐量影响（mmol·L-1）

15 30 60 120正常组 5.37±0.23 22.74±2.0917.37±2.21 9.97±1.40 7.68±0.53高脂组 10.81±0.4133.06±2.8431.46±2.4828.13±2.2013.33±0.66组别 时间（分钟）0

2.2 高脂饮食增强HSP60及内质网应激相关分子的表达

正常饮食或高脂饮食喂养16周后，各组小鼠骨骼肌组织通过免疫印迹实验检测HSP60表达，正常对照组HSP60表达比HFD组显著增加。同时，HFD组小鼠骨骼肌中内质网应激相关蛋白质CHOP、ClpP表达水平均比正常组增强，而XBP1s、 XBP1u表达无明显变化。见图1。

图1 高脂饮食小鼠骨骼肌HSP60和内质网应激相关蛋白质CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u电泳条带及相对密度值（⋆P＜0.05）

3 讨论

内质网是真核细胞内重要细胞器，在受到外界条件的刺激下引发内质网应激（ERS），适应性地抑制蛋白质合成、加速蛋白降解等缓解ERS，协助细胞的自身修复。HSP60主要存在于真核细胞线粒体中，并被证实与自身免疫性等疾病发病相关。在生理状态下，HSP60主要通过与凋亡相关因子的相互作用以及减少线粒体产生氧自由基而发挥抗凋亡效应。尽管已有研究表明，肥胖小鼠肝脏中出现氧化应激是ERS的开始的主要标志，而后引起线粒体功能异常。体外实验表明，抑制内质网应激还可阻止细胞凋亡和肌纤维的分化，说明内质网应激可促进肌细胞形成。研究还显示锻炼加上饮食的改善可提高葡萄糖耐受性受损个体的HSP60和GRP75在肌肉中的表达。在本研究中，长期高脂饮食可明显增加小鼠体重和降低葡萄糖耐量，小鼠骨骼肌中内质网应激标志物CHOP表达上调，其相关蛋白ClpP表达也上调，而XBP1及其剪切形式变化不明显。可以认为高脂饮食引起的胰岛素抵抗中HSP60与内质网应激的激活有关系。随着对HSP60及肥胖糖尿病发病机制的进一步研究，HSP60可能成为预测糖尿病早期发生的一个新指标。

（作者单位：长沙医学院基础医学院）

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罗玥佶

湖南省教育厅科研项目（湘财教[2014]85号14C0130;湘财教[2015]54号15C0154）;长沙医学院科研项目（长医研[2014]2号-KY201442）