碳黑和碳黑与铅复合物对小鼠肺部损伤作用机理

木 魁，姜 楠，尚梦婷，温海燕，姜双林

阜阳师范学院 1.生命科学学院，2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳,236037

碳黑和碳黑与铅复合物对小鼠肺部损伤作用机理

木 魁1,2，姜 楠1,2，尚梦婷1,2，温海燕1,2，姜双林1,2

阜阳师范学院 1.生命科学学院，2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳,236037

目的评估大气中碳黑和碳黑与铅复合物对活体动物肺部的损伤作用，从氧化应激和炎症损伤两个方面探讨毒性机理。方法将30只6周龄雌性昆明白小鼠体重为(25.0±1.3)g，随机分成3组，每组10只。碳黑和碳黑与铅的复合物(硝酸铅∶碳黑为1∶250)用磷酸盐缓冲液制成悬液对小鼠进行气管滴注，剂量为4 mg·kg-1小鼠体重，滴注量为50 μL，空白组用磷酸盐缓冲液处理，染毒1次，72 h后处死小鼠。对小鼠肺部进行病理学切片，并检测肺灌洗液生理生化指标，测得乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量，炎症指标的白细胞介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，以及肺部酶活力超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、 酸性磷酸酶(ACP)活性。结果通过对病理学观察分析，染毒组肺部出现炎症损伤。染毒组LDH和MDA均显著高于对照组(P<0.01)；IL-8含量高于对照组(P<0.05)；TNF-α含量显著高于对照组(P<0.05)；染毒组酶活力(SOD、AKP、ACP)也均高于对照组。结论小鼠肺部在短期高剂量的碳黑和碳黑与铅复合物暴露下，引起急性炎症损伤，黑碳与铅复合物毒性高于黑碳。

碳黑；小鼠；作用机理

1 相关研究与问题提出

我国黑碳颗粒的排放约占全球的四分之一，中国大陆黑碳排放总量约达到181×104t[1-2]。黑碳颗粒是PM2.5的主要组分之一，也是PM2.5传输和吸附有毒有害物质的载体，能诱发呼吸系统疾病的发生[3]。碳黑因孔隙发达,粒径小，比表面积大，具有极强的吸附重金属离子(如Pb、Cd、Zn、Mn、Cr等)能力。碳黑吸附重金属离子后，形成黑碳-污染物复合体[4]。

空气中的铅主要来源于燃油和燃煤排放，它与空气中的黑碳结合，形成二次黑碳粒子，即黑碳与铅的复合物。Liu等人研究发现，黑碳(一次性黑碳)暴露于O3后制备的二次黑碳(黑碳-臭氧复合体)的氧化损伤和细胞毒性效应明显增强[5]。Renwick等采用黑碳制成悬液对大鼠做气管滴注，经LDH法研究颗粒物对肺泡巨噬细胞的毒性作用，结果显示黑碳对肺泡巨噬细胞有明显的毒性作用，随着浓度的升高，各组肺泡巨噬细胞吞噬荧光胶珠的荧光强度明显降低，提示肺泡巨噬细胞在吸入颗粒物后的吞噬功能逐渐降低，并且相对于PM2.5，黑碳对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的损伤更大[6]。Diabaté等研究了黑碳标准品、粉煤灰及其不同组分诱发人肺上皮细胞的炎症反应的机制，发现粉煤灰的不溶性过渡金属组分Pb、Zn、Fe能诱导ROS和tGSH的含量升高，并诱导产生了HO-1、Nrf2以及IL-6、IL-8、COX-2、TNF-α等细胞因子基因的高表达；而黑碳也能诱导ROS的产生，但不能诱导产生HO-1[7]。

本实验采用商品化碳黑和碳黑与铅复合物对昆明白小鼠进行气管滴注染毒，摘取小鼠肺部进行病理学分析和肺灌洗液生理生化指标的检测，探讨碳黑和碳黑与铅复合物诱发肺部氧化损伤、炎症反应和代谢酶活性，为揭示碳黑和碳黑与铅复合物对生物健康安全效应研究提供参考。

2 材料与方法

2.1 主要试剂

总蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品，白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒为IBL International产品，Multiskan GO型酶标仪为美国Thermo公司产品 。

2.2 碳黑和碳黑与铅复合物悬液制备

本实验使用的碳黑为商品化碳黑C824455(麦克林)，碳黑与铅的复合物在常温下与硝酸铅标准液中混合，80℃水浴加热搅拌至碳黑悬浮于溶液中，蒸干至恒重，然后转到坩埚再在马弗炉中300℃加热3 h制备成硝酸铅与碳黑比例为1∶250的样品。经过与硝酸铅复合的碳黑能稳定结合，粒径有所增加。用磷酸盐缓冲液配置碳黑和碳黑与铅的复合物的1 mg·mL-1浓储液，超声30 min后备用。

2.3 动物分组与暴露

30只健康清洁级昆明白小鼠6周龄雌鼠，体重为(25.0±1.3)g，购入后适应性饲喂1周，小鼠自由饮水取食，随机分成3组，每组10只。碳黑和碳黑与铅的复合物(硝酸铅∶碳黑为1∶250)用磷酸盐缓冲液制成悬液对小鼠进行气管滴注，剂量为4 mg·kg-1体重，滴注量为50 μL，空白组用磷酸盐缓冲液处理，染毒1次，72 h后处死小鼠，摘取小鼠肺部。

气管滴注方法[8]：配置1%戊巴比妥钠，按照3 mL·kg-1体重麻醉小鼠，在静脉留置针去针头的PVC软管内横向注入50 μL含颗粒物的液体，将PVC软管插入小鼠声门裂，当小鼠呼吸与留置针内液体波动一致即可，随后将含颗粒物液体打入气道。

2.4 病理学检查和生理生化指标检测

2.4.1 小鼠右肺组织病理学切片

摘取小鼠右肺，经过固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，制成石蜡切片进行病理学检查。

2.4.2 小鼠左肺灌洗液指标检测

用冷PBS反复灌洗小鼠左肺，肺灌洗液经过低温离心机4 400 r/min离心10 min，对上清液测定总蛋白(BCA法)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的含量，严格按照试剂盒说明书进行测定。

2.5 统计分析

实验所得数据用GraphPad Prism软件分析，P<0.05表明具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。

3 结 果

小鼠在实验过程中自由饮水取食，未发现异常，体重变化没有统计学意义，期间无中毒迹象，无死亡。

3.1 肺组织切片观察

电镜观察对照组PBS滴注的小鼠肺组织切片，结果显示肺泡均匀、大小正常，肺泡壁薄而光滑，肺泡腔无渗出异物，间隔均匀。碳黑处理组可见肺组织出现炎性改变，肺泡间隔，不均匀，肺泡壁增厚，间质炎细胞浸润，肺泡腔变小，气腔变大。碳黑与铅的复合物处理组肺组织炎性更严重，肺泡结构遭到严重破坏，肺泡壁增厚，肺泡腔变小，气管腔进一步变大，炎细胞浸润严重，血管内淤血。

图1 小鼠肺部病理图片( HE×100)

3.2 氧化损伤指标

图2 不同材料肺灌洗液LDH活性

图3 不同材料肺灌洗液MDA含量

如图2，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中LDH活性水平均显著高于空白对照组(P<0.01)，碳黑与铅复合物处理组中LDH活性水平高于其他两组(P<0.05)。如图3，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中MDA含量均显著高于空白对照(P<0.01)，碳黑处理组比对照组MDA含量升高1.8倍，碳黑与铅复合物处理组比对照组MDA含量升高1.9倍。各组间具有统计学差异(P<0.05)。

3.3 炎症损伤指标

如图4，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中IL-8含量均高于对照组(P<0.05)，碳黑处理组比对照组MDA含量升高了11.91%，碳黑与铅复合物处理组比对照组MDA含量升高了52.32%。如图5，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中TNF-α含量均高于对照组(P<0.01)，碳黑处理组比对照组TNF-α含量升高了35.42%，碳黑与铅复合物处理组比对照组TNF-α含量升高了36.93%。各组间具有统计学差异(P<0.05)。

图4 不同材料肺灌洗液IL-8含量

图5 不同材料肺灌洗液TNF-α含量

3.4 肺组织代谢酶活性

图6 不同材料肺灌洗液SOD活性

如图6，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中SOD含量均高于对照组(P<0.01)，碳黑处理组比对照组SOD活性升高了14.89倍，碳黑与铅复合物处理组比对照组SOD活性升高了30.61倍。如图7，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中AKP活性均高于对照组，碳黑处理组比对照组AKP活性升高了1.69倍，碳黑与铅复合物处理组比对照组AKP含量升高2倍，但组间差异无统计学意义。如图8，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组中ACP活性均高于对照组，碳黑处理组比对照组ACP活性升高了1.23倍，碳黑与铅复合物处理组比对照组ACP含量升高了2.01倍,各组间具有统计学差异(P<0.01)。

图7 不同材料肺灌洗液AKP活性

图8 不同材料肺灌洗液ACP 活性

4 讨 论

4.1 氧化损伤方面

正常情况下,体内氧化和抗氧化处于动态平衡状态，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组能引起机体发生氧化应激反应。

乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，当细胞膜受损或通透性增加时可漏至细胞外,导致细胞外液中LDH 的活性增加[9]。LDH活性的高低能反映膜损伤程度。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度。结果表明，碳黑与铅复合物处理组比碳黑处理组产生的LDH和MDA的水平更高。可见,碳黑与铅复合物处理组和碳黑处理组均能引起肺部组织细胞膜损伤和脂质过氧化，且碳黑与铅复合物处理组的损伤更严重。

4.2 炎症损伤方面

机体遭到外源物质入侵可激活免疫系统，产生单核细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF和M-CSF等)，募集免疫细胞保护机体，但过量的单核细胞因子对机体有害[10]。

白细胞介素-8(IL-8)又称嗜中性粒细胞因子，是炎症性疾病的重要介质，在抗感染、免疫反应调节以及抗肿瘤方面有重要作用，可以通过IL-8水平反映肺组织产生炎症的程度。肿瘤坏死因子TNF-α是一种单核细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，是具有重要生物学活性的炎性介质，同样可以通过TNF-α水平反映肺组织炎症反应程度。实验结果表明，碳黑与铅复合物处理组和碳黑处理组的肺组织内IL-8和TNF-α水平都显著高于对照组(P<0.05)，碳黑与铅复合物处理组均高于碳黑处理组，肺组织释放大量的IL-8和TNF-a,导致肺部受损。因此,碳黑与铅复合物处理组和碳黑处理组均能引起肺部组织炎症损伤，且碳黑与铅复合物处理组引起的肺组织炎症损伤更严重。

4.3 肺组织代谢酶活性

SOD是一种重要的抗氧化酶,能够清除机体超氧阴离子自由基，在防御机体衰老和DNA 损伤以及保护细胞等方面发挥重要作用[11]。细胞受到损伤时，SOD出现应激性升高。酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)是两种重要的机体功能调节酶。酸性磷酸酶广泛分布于生物界，是一种磷酸酯酶，大量研究表明磷酸酶活力是细胞和体液免疫的综合体现，也是衡量免疫功能和机体状态的指标，反映机体对外源物侵染的防御能力。在动物实验方面证明，肺组织细胞破损后，细胞外SOD、ACP和AKP均显著升高[11]。

当小鼠被黑碳及黑碳与铅复合物染毒后，体内酸、碱性磷酸酶的活性会受到不同程度的影响。肺部产生炎症时，SOD、ACP和AKP含量均升高，且黑碳-铅复合物比黑碳的影响更加显著。因此，碳黑与铅复合物处理组和碳黑处理组均能引起肺部组织损伤，且碳黑与铅复合物处理组引起的肺组织损伤更严重。

综上所述，碳黑和碳黑与铅复合物均能引起小鼠肺部组织损伤，主要包括氧化损伤和炎症损伤两个方面，且碳黑与铅复合物对肺部损伤比纯碳黑更严重，但有关损伤机理需要进一步研究。

[1]Streets D G,Gupta S,Waldhoff S T,et al.Black carbon emissions in China Atmos[J].Environ,2001,35:4281-4296

[2]Menon S,Hansen J,Nazarenko L,et al.Climate effects of black carbon aerosols in China and India[J].Science,2000,297:2250-2253

[3]Dockery DW,Pope CA,Xu X.An association between air pollution and mortality in six US cities[J].N Engl J Med,2003,329:1753-1759

[4]Pope CA,Hansen ML.Ambient particulate air pollution,heart rate variability,and blood markers of inflammation in a panel of elderly subjects[J].Environ Health Persp,2004,112:339-345

[5]Liu Y,Liu C,Ma Q,et al.Structural and hygroscopic changes of soot during heterogeneous reaction with O3[J].Phys Chem Chem Phys,2010,12:10896-10903

[6]Renwick L C,Brown D,Clouter A,et al.Increased inflammation and altered macrophage chemotactic responses caused by two ultrafine particle types[J].Occup Environ Med,2014,81:442-447

[7]Diabaté S,Britta B B,Plaumann D,et al.Anti-oxidative and inflammatory responses induced by fly ash particles and carbon black in lung epithelial cells[J].Anal Bioanal Chem,2011,401:3197-3212

[8]贾晓峰,郭新彪.改进型快速小鼠气管滴注法:透射灯下经口直视滴注法研究[J].环境与健康杂志,2012(3):217-219

[9]刘芳,杨翠军,李志军,等.小鼠实验性缺氧脑和肺组织MDA、LD含量和LDH活性变化[J].安徽农业科学,2012(4):2044-2045

[10]李容汉,李琼珍,邓群娣,等.儿童支原体肺炎血清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10浓度临床研究的意义[J].中国妇幼卫生杂志,2014(5):32-35

[11]Mendola P,Wallace M,Liu D,Robledo C,et al.Air pollution exposure and preeclampsia among us women with and without asthma[J].Environ Res，2016，148:248-255

(责任编辑：汪材印)

R114

A

1673-2006(2017)09-0111-04

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.026

2017-05-26

国家自然科学基金重大研究计划项目“黑炭和黑炭-污染物复合体诱发肺部炎症反应的作用机理研究”(91643113)。

木魁(1990-)，安徽亳州人，在读硕士研究生，研究方向：环境毒理学。