环介导恒温扩增法快速诊断肺结核的临床评价

(太原市第四人民医院，山西 太原 030053)

环介导恒温扩增法快速诊断肺结核的临床评价

郗志华

(太原市第四人民医院，山西 太原 030053)

目的探讨环介导恒温扩增法在肺结核诊断中的价值。方法回顾性分析36例痰结核菌培养阳性患者，比较涂片抗酸染色法、环介导恒温扩增法的阳性率。结果环介导恒温扩增法的阳性率77.78%，涂片抗酸染色法的阳性率52.78%，差异有统计学意义(P<0.05)；涂阳培阳，环介导恒温扩增法的阳性率94.73%；涂阴培阳，环介导恒温扩增法的阳性率58.82%。结论环介导恒温扩增法在肺结核诊断中有重要价值。

环介导恒温扩增法；结核分枝杆菌；肺结核

细菌学检查是诊断结核病的金标准，是结核病诊断和化疗的重要依据。但由于传统涂片敏感性低，培养所需时间长等原因，致使病原学检查一直不能满足临床诊治的需求，误诊和误治时有发生，影响了治疗效果，加重患者心理和经济负担，也使得疾病易于传播。因此，早期、准确和快速的诊断技术是控制全球结核病的关键。

近年发展起来的环介导等温扩增技术，是由Notomi等[1]设计用于病原微生物的检测，该技术不需要昂贵仪器设备，操作简单，价格适中。给结核病的快速诊断带来了希望。现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年10～11月于太原市第四人民医院就诊的疑似肺结核患者，痰结核菌培养确诊36例，男20例，女16例；年龄17～81岁，平均(42.3±3.1)岁。

1.2 试剂与仪器

二级生物安全柜(海尔)，抗酸染液，BACTEC MGITBD960液体快速培养(美国BD公司)， 结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂(恒温扩增法，广州迪奥生物科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色 用竹签挑取脓性痰液在玻片2/3处涂抹均匀，面积为1 cm×2 cm，行抗酸染色，镜检。参照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[2]

1.3.2 BACTEC MGITBD960液体快速培养及罗氏比例法药敏 吸取2mL痰液，加入2倍的 2%枸橼酸钠 半胱氨酸-氢氧化钠(2%NALC-NaOH)前处理液，旋窝震荡 20 s。室温静置 15～20 min，请勿超过 20 min。加无菌磷酸盐缓冲液 PBS(pH6.8)至约 40 mL，盖紧盖子，3 000 rpm离心 15 min，倒掉上清液。添加 1～3 mL PBS(pH6.8)以中和 pH 至 6.8。取处理后标本 0.5 mL加入准备好的 MGIT 培养管培养。参照《分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册》[3]，培养阳性时涂片确认。

1.3.3 结核分枝杆菌复合群核酸检测(恒温扩增法) 在痰液中加入等体积4%NaOH溶液,涡旋振荡30s，室温下放置15 min，使其充分液化。取1 mL液化后的痰液至1.5 mL离心管，12 000 rpm离心5 min，弃上清。沉淀用1 mL灭菌生理盐水悬浮，12 000 rpm离心5 min，弃上清。向含沉淀物的离心管中加入100μL的DNA提取液，震荡混匀。100℃恒温处理10 min。12 000 rpm离心2 min，上清液做为模板备用。将模板DNA和对照品2.0μL分别加入到对应的反应管中10 000 rpm离心5 s。放入扩增仪编辑开始。

1.4 质量控制

所有操作均在安全柜内进行，参加国家结核病实验室药敏熟练度测试，以 H37RV标准株作为阳性参照，加以质控检测。

1.5 统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析。计数资料以%表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本实验以罗氏培养为金标准，环介导恒温扩增法的阳性率77.78%(28/36)，涂片抗酸染色法的阳性率52.78%(19/36)；涂阳培阳，环介导恒温扩增法的阳性率94.73%(18/19)；涂阴培阳，环介导恒温扩增法的阳性率58.82%(10/17)，差异有统计学意义(χ2=4.96，P=0.03)。见表1。

表1 环介导恒温扩增法与涂片抗酸染色法检测结果比较

3 讨论

近年来，世界卫生组织以及其他国际组织对全球结核病的控制加大了新方法、新化疗药物以及新疫苗研发的投入力度。据世界卫生组织结核病控制2009年报告，有许多国家完成并提交了结核病新诊断方法的实践报告，部分新诊断方法已进入临床试验阶段。 环介导恒温扩增法技术原理：采用恒温扩增技术，通过Bst聚合酶及特异性引物在恒温条件下对标本中结核分枝杆菌复合群核酸片段进行特异性扩增，扩增产物(DNA)与核酸染料结合后发出荧光信号，根据仪器给出的扩增曲线和出峰时间判断结果，可以快速对人痰标本中的结核分枝杆菌复合群DNA进行定性检测。环介导恒温扩增法技术的优势：a)同涂片抗酸染色相比，肺结核患者的阳性检出率提高。b)检出时间大约需要1 h左右，有利于快速诊断及控制传染。c)等温扩增的操作简单，技术要求低，同时不需要昂贵的扩增仪器。本研究中以快速培养为金标准，环介导恒温扩增法阳性率为77.78%低于江勇等[4]，可能原因是：一是标本例数少，不典型；二是阳性标准不一样。涂阳培阳，环介导恒温扩增法的阳性率94.73%；涂阴培阳，环介导恒温扩增法的阳性率58.82%与戴光明等[5]接近。

本研究显示，环介导恒温扩增法优于涂片检测，方法简便易行、灵敏度高、对检验条件要求低等特点，适合于基层实验室应用，在肺结核诊断中有重要价值。

[1] Notomi T，OkayamaH，MasubuchiH，et a1．Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Res，2000，15，28(12)：63.

[2] 中国疾病预防控制中心.痰涂片镜检质量保证手册[M].北京：中国协和医科大学出版社, 2004.

[3] 赵雁林，王黎霞，成时明，等.分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013.

[4] 江 勇，钱 明，陈 涛，等.环介导等温扩增对肺结核快速诊断的分析研究[J].实用医学杂志，2013，29(23)：3818-3820.

[5] 戴广明，曹以诚，杜正平，等.结核分枝杆菌环介导恒温扩增(LANP)快速检测方法的评价[J].中国防痨杂志，2011，33(1):47-51.

本文编辑：王知平

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1671-0126(2017)05-0028-03

郗志华，男，检验师，从事临床检验工作