神阙灸法治疗EAT模型小鼠的疗效及机制初探

陈若暘，高建芸，苏方方，王桂英

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 针灸科，江苏 南京 210009)

·论著·

神阙灸法治疗EAT模型小鼠的疗效及机制初探

陈若暘1，高建芸2，苏方方1，王桂英2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 针灸科，江苏 南京 210009)

目的观察神阙灸法对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)模型小鼠的疗效并探讨可能机制。方法运用猪甲状腺球蛋白(PTg)皮下多点免疫联合饮用高碘水的方法制作小鼠EAT模型，并随机分为空白组、模型组、治疗组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠促甲状腺素(TSH)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平；苏木素- 伊红染色(HE)观察甲状腺及神阙穴局部皮肤组织形态；免疫组织化学法检测甲状腺、神阙穴局部皮肤组织中的转化生长因子- β1(TGF- β1)、瞬时受体电位香草酸亚家族- 1(TRPV1)水平。结果与模型组相比，治疗组小鼠甲状腺组织充血、水肿、滤泡上皮变性坏死和炎症细胞浸润均较轻，甲状腺球蛋白合成正常，且小鼠血清TGAb水平显著下降(P<0.05)，神阙穴局部皮肤组织TGF- β1、TRPV1表达增强(P<0.05)，而血清TSH、甲状腺组织TGF- β1、TRPV1水平未见显著差异(P>0.05)。结论神阙灸法能够显著减轻EAT小鼠甲状腺组织炎症反应，其疗效可能与神阙灸法激活局部组织TGF- β1、TRPV1表达，继而抑制免疫反应，使EAT小鼠甲状腺自身抗体水平下降有关。

实验性自身免疫性甲状腺炎； 神阙穴； 灸法； 小鼠

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是器官特异性的甲状腺自身免疫疾病，主要病因是自身免疫损伤。以甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)滴度显著增高为主要诊断要素。临床通常采用左旋甲状腺素(L- thyroxine，L- T4)替代治疗或激素疗法进行治疗，以上疗法对甲状腺功能改善作用较显著，但对甲状腺自身抗体水平改善较小[1]。

AIT属于中医“瘿病”范畴，为本虚标实之证，多由脾肾亏虚、肝郁气滞、痰瘀互结所致[2]。目前中医疗法多选用中药或针刺疗法以温阳益气、疏肝理气、活血化瘀，效果肯定[3- 5]，但确切机制尚不清楚。灸法为中医外治法之一，其治疗AIT的相关研究报道较少，机制不明。其中神阙灸法长于温阳益气，临床疗效明显，故本研究使用神阙灸法治疗实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)模型小鼠并探讨可能的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

猪甲状腺球蛋白PTg(018K7012V，天府新区华阳正龙生化制品研究室，中国)；完全弗氏佐剂(SLBK7817V，SIGMA，美国)；不完全弗氏佐剂(SLBL9742V，SIGMA，美国)；碘化钠(C10040497，MACKLIN，中国)；丙硫氧嘧啶片(上海朝晖药业有限公司，规格：50mg×100片，国药准字H31021082)；促甲状腺素、抗甲状腺球蛋白 ELISA检测试剂盒(上海江莱生物有限公司，中国)；动物用细艾条(南阳汉医艾绒有限公司，中国)；乙醚、40%甲醛、无水乙醇、 二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，中国)；一抗：兔抗- TGFβ1、兔抗- TRPV1，SV0002- 兔IgG两步法免疫组化检测试剂盒，DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 EAT小鼠模型制备

造模前，采用随机数字表法将小鼠随机分为空白组14只和模型组28只。于实验第1、8、15天进行初次免疫。取PTg溶于PBS缓冲液中，配制成浓度为0.5mg·ml-1的溶液，与完全弗氏佐剂按1.2∶1体积混合，乳化充分后形成油包水制剂。模型组小鼠颈背部及腹股沟皮下多点注射，甲状腺球蛋白的注射剂量为50μg·只-1；在同一时间及相同部位对空白组小鼠注射同等剂量的生理盐水。于实验第22、29天加强免疫两次。加强免疫时，将完全弗氏佐剂改为不完全弗氏佐剂，其余方法同初次免疫。

造模期间，模型组饮用高碘水，即0.05%碘化钠(NaI)溶液，隔天更换。空白组正常饮水。造模结束1周后(实验第36天)，取空白组4只、模型组8只小鼠，处死后作病理检查，了解造模情况。将剩余的30只小鼠纳入艾灸实验，其中20只模型组小鼠再次按随机数字表分入模型组和治疗组，每组10只。均正常饮水1周后开始治疗，并饮用含有0.1%丙硫氧嘧啶(PTU)的双蒸水；空白组小鼠正常饮水，直至实验结束。

1.4 神阙穴艾灸治疗

1.4.1 分组干预 空白组与模型组小鼠不进行任何治疗，只做与治疗组相同的固定。治疗组小鼠治疗方法如下：小鼠腹部剃毛，取神阙穴，穴位定位参照《实验针灸学》[6]。抓握并固定小鼠，暴露腹部，用点燃的动物用艾条对神阙穴施悬起灸，施灸过程中采用红外体表测温器控制施灸处体表温度在(44±1)℃，每只小鼠治疗10min。每5d为1个疗程，其中连续治疗4d，休息1d。持续3个疗程。治疗结束后第3天处死全部动物。

1.4.2 样本采集与处理 实验结束后，小鼠乙醚麻醉后摘眼球采血处死，立即取甲状腺和腹部皮肤，于4%中性甲醛溶液中固定。小鼠腹部所取皮肤呈菱形，以脐(神阙穴)为中心，面积约1.5 cm×1.5 cm。所取血样于室温静置2h后以3500r·min-1离心10min，取上层血清于EP管中，-80℃保存待用。

1.5 观察指标

1.5.1 血清促甲状腺素(TSH)、TGAb水平 采用ELISA法检测小鼠TSH、TGAb水平。严格按照试剂盒步骤，取待测血清加入相应试剂，酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算出待测样本的浓度。

1.5.2 神阙穴皮肤、甲状腺组织形态 小鼠神阙穴皮肤、甲状腺于4%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，制作4μm厚切片，HE染色，光学显微镜观察。

1.5.3 神阙穴皮肤、甲状腺组织中瞬时受体电位香草酸亚家族-1(TRPV1)、转化生长因子-β1(TGF- β1)表达 采用4%中性甲醛溶液固定、常规石蜡包埋、切片、免疫组织化学SP法、DAB显色，检测TRPV1、TGF- β1表达及分布。所有切片的光镜观察均采用人工计数分析，每张切片选择10个具有代表性的高倍视野 (10×40倍)，计数标记定位准确的阳性细胞占视野中所有细胞的比例并记分。阳性标准：黄色或棕黄色颗粒特异性分布于胞浆者为阳性。阳性细胞数占总细胞数的25%以下为(±)，25%～50%为(+)，51～75%为(++)，75%以上为(+++)，依次赋值为1、2、3、4分；染色强度依次以浅黄(±)、黄(+)、棕黄(++)表示，分别赋值为1、2、3分；最后计算两种记分的乘积作为阳性指数。

贫困是一个世界性难题，有学者认为贫困是经济、社会、文化贫困落后现象的总称。2015年11月27日至28日，中央扶贫开发工作会议在北京召开。中共中央总书记习近平出席会议并发表重要讲话。他强调，消除贫困、改善民生、逐步实现共同富裕，是社会主义的本质要求，是我们党的重要使命。脱贫攻坚战的冲锋号已经吹响，我们要立下愚公移山志，咬定目标、苦干实干，坚决打赢脱贫攻坚战，确保到2020年所有贫困地区和贫困人口迈入全面小康社会[1]。

1.6 统计学处理

所有数据采用SPSS16.0统计学软件进行处理，数据以均数±标准差表示，对各组进行正态性检验与方差齐性检验，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用方差分析，并使用LSD法进行多重比较；不服从正态分布者或方差不齐者使用非参数检验。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 成功建模

2.1.1 小鼠甲状腺组织形态 经HE染色后在光镜下观察，空白组甲状腺滤泡上皮呈立方状，排列整齐，无变性坏死；滤泡腔内充满胶质，胶质稠厚，无吸收空泡。间质无明显增生，无血管充血及炎症细胞浸润。甲状腺包膜完整，无增厚，无腺体或异型细胞浸润。偶可见细胞呈实性排列的甲状旁腺，无变性坏死或异常增生(图1A)。模型组甲状腺滤泡多数形态正常，部分滤泡上皮变性坏死脱落，胶质稀薄。间质存在不同程度的淋巴细胞浸润，间质充血，纤维结缔组织增生，部分区域间质水肿(图1B)。

A. 空白组；B. 模型组

图1实验第36天甲状腺组织形态HE×200

Fig1Histopathologyofthethyroidglandinday36HEstaining×200

2.1.2 EAT小鼠血清TSH、TGAb水平 实验第36天，模型组与空白组血清TSH水平的差异无统计学意义(P>0.05)；模型组较空白组血清TGAb水平升高趋势较明显，P=0.059，但>0.05，差异尚无统计学意义。见表1。

2.2 治疗效果

2.2.1 小鼠甲状腺、神阙穴局部皮肤组织形态 空白组甲状腺形态正常，无滤泡上皮增生，无间质纤维化和炎症细胞浸润；胶质稠厚，无吸收空泡。模型组甲状腺滤泡上皮略扁平，胶质普遍稀薄，胶质轻度水肿，淋巴细胞浸润(图2A)。治疗组所有动物甲状腺滤泡上皮呈立方状，无增生及变性坏死，胶质稠厚，无吸收空泡；少数动物甲状腺间质轻度增生，偶见淋巴细胞浸润(图2B)。

组 别TSH/μIU·L-1TGAb/IU·ml-1空白组101.99±23.95100.67±11.29模型组110.53±29.43132.82±39.00t值-0.500-2.158P值0.6280.059

A. 模型组；B. 治疗组

图2实验第60天甲状腺组织形态HE×200

Fig2Histopathologyofthethyroidglandinday60HEstaining×200

空白组和模型组皮肤结构清楚，毛囊、皮脂腺清晰可见；真皮层组织疏松，无充血及急、慢性炎症细胞浸润；真皮下为肌肉组织；上述组织结构均无变性坏死(图3A)。治疗组皮肤的组织结构基本正常，仅见真皮内小血管轻度充血，散在中性粒细胞或淋巴细胞浸润(图3B)。

A. 模型组；B. 治疗组

图3皮肤组织形态HE×200

Fig3HistopathologyoftheskinHEstaining×200

2.2.2 小鼠血清TSH、TGAb水平 治疗结束后，治疗组、模型组与空白组血清TSH水平的差异无统计学意义；治疗组、模型组和空白组血清TGAb水平的差异有统计学意义(P<0.05)。其中，模型组较空白组血清TGAb水平显著升高(P=0.007，P<0.05)；空白组与治疗组血清TGAb水平的差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组较模型组血清TGAb水平有显著差异(P=0.036，P<0.05)。见表2。

组 别TSH/μIU·L-1TGAb/IU·ml-1空白组103.19±21.1492.49±33.35模型组105.11±24.50146.50±27.43a治疗组107.65±48.19106.54±29.07bF值0.0275.218P值0.9740.019

与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05

2.2.3 小鼠甲状腺、神阙穴局部皮肤组织内TRPV1、TGF- β1表达 甲状腺组织TRPV1表达仅模型组间质纤维细胞弱阳性，空白组和治疗组均阴性。甲状腺TGF- β1在各组均为阴性表达。皮肤TGF- β1在空白组、模型组表皮、毛囊上皮细胞和部分间质细胞弱到中等程度阳性(图4A)；治疗组表皮、毛囊上皮细胞和间质细胞强阳性，呈深棕色颗粒(图4B)。皮肤TRPV1在空白组和模型组毛囊上皮细胞、皮下少量间质细胞弱阳性(图4C)；治疗组上皮细胞、皮下结缔组织中间质细胞中等至强阳性(图4D)。

半定量分析显示，3组小鼠神阙穴皮肤组织TRPV1阳性指数的差异具有统计学意义(P<0.05)，且治疗组的TRPV1表达显著高于空白组、模型组；3组小鼠小鼠神阙穴皮肤组织TGF- β1阳性指数的差异具有统计学意义(P<0.05)，且治疗组的TGF- β1表达显著高于空白组、模型组。见表3。

3 讨 论

艾灸疗法作为中医外治法的一种，在临床上常被单独或辅助用于治疗AIT患者，可降低甲状腺自身抗体水平、改善甲状腺功能[7]，但其治疗机制尚不明确。

A. 模型组(TGF- β1)；B. 治疗组(TGF- β1)；C. 模型组(TRPV1)； D. 治疗组(TRPV1)

图4皮肤组织免疫组化染色SP×200

Fig4ImmunohistochemicallocalizationofTRPV1andTGF-β1inskintissueSP×200

组 别TRPV1阳性指数TGF-β1阳性指数空白组1.60±0.491.60±0.49模型组1.50±1.221.67±1.21治疗组10.00±2.459.50±2.95F值a44.71635.080P值0.0000.000

a原始数据方差不齐，经对数转换后进行方差分析

中医并无AIT的病名，根据其临床症状可归属于“瘿病”、“虚劳”范畴，主要责之肝、脾、肾。病程迁延日久，耗伤正气，阴损及阳，终而脾肾阳虚，若超量补充L- T4又可出现气阴两虚证。艾灸因其温热特性被广泛应用于虚性、寒性病症，具有温补、温通的作用，适用于AIT中后期患者通常表现出的脾肾阳虚症状。从本实验结果来看，艾灸EAT模型小鼠的神阙穴确实下调TGAb水平，增加甲状腺球蛋白(TG)分泌水平，使病情有明显改善，与以往学者的实验观察结果[7- 8]一致。从选穴来看，既往研究多选用关元、命门，本实验则选择特定穴位神阙穴。由于神阙穴位处任脉，为阴脉之海，走行经过位于颈部前方的甲状腺；且任、督和冲脉“一源三岐，皆络带脉”；另有足阳明胃经夹脐，足太阴之筋结于脐，手太阴之筋下系于脐，足少阴肾经与冲脉夹脐上行，足厥阴肝经上行入脐中[9]。故神阙穴为后天气机升降转承的枢纽，可激发机体脏腑经络气血的运行。此次实验中，我们单独选择神阙穴并取得了一定的实验成果，但也提示我们在进一步的实验研究和临床治疗中还可以对具体选穴以及灸法的量效关系进行更深入的研究。

现代医学研究认为，AIT发病机制与Treg/Th17细胞轴平衡失常有关[10- 12]。AIT时，造成Treg/Th17细胞轴不平衡的原因众说纷纭，但是TGF- β1作为一种自身免疫相关的细胞因子，对于Treg/Th17细胞轴的影响是不可忽视的。所以我们在实验中观察了艾灸神阙穴对于EAT模型小鼠的神阙穴局部组织以及甲状腺组织中TGF- β1水平的影响。实验结果显示治疗组脐周皮肤组织的TGF- β1水平显著升高，血清TGAb水平下调，HE染色显示甲状腺滤泡腔内胶质稠厚，与空白组在形态上相近，模型组滤泡腔内胶质普遍稀薄。由以上结果我们推断，神阙灸法可能通过激活脐周皮肤组织局部的TGF- β1细胞因子，上调循环血液中TGF- β1水平，进而恢复Treg的功能，最终平衡Treg/Th17细胞轴，减少甲状腺球蛋白抗体，减轻甲状腺炎症，恢复滤泡上皮细胞损伤，使甲状腺功能趋于正常。

近年来，关于艾灸温热作用的疗效机制研究较多。学者们认为，适宜的灸温下激活温热觉感受通道蛋白TRPV(瞬时受体电位香草酸亚家族)，可实现艾灸的温通作用，并达到灸法抗炎的疗效[13]。其中，TRPV1是一类分布在外周伤害性感受器上的非选择性阳离子通道，可被伤害热(>43℃)、辣椒素等多种物理及化学刺激所激活。实验中我们发现，艾灸后治疗组局部皮肤组织中TRPV1水平显著上调，由此我们推测，治疗组的疗效可能并不是TGF- β1的单一作用。艾灸时激活神阙穴局部组织的TRPV1通道可能从中枢调节了下丘脑- 垂体- 甲状腺轴的功能，体现出艾灸激活TRPV1在“穴位(区)启动- 中枢响应”的过程中重要的信号传递作用。

神阙灸法在临床上应用甚广，在AIT的治疗方面文献报道较少，机理尚不明确。此次我们的研究初步建立了EAT小鼠模型，施用神阙灸法并取得了一定的疗效，仍需增加样本量重复实验研究。本次实验中，HE染色下观察到模型组小鼠甲状腺滤泡内胶质明显稀薄，治疗组与空白对照组胶质稠厚，但是血清TSH检测却并无显著差异，有待在后续研究中进一步验证。

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EffectandpossiblemechanismofShenque(CV8)moxibustiontherapyonthemicewithautoimmunethyroiditis

CHENRuo-yang1,GAOJian-yun2,SUFang-fang1,WANGGui-ying2

(1.MedicalSchoolofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China; 2.DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,ZhongdaHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective: To investigate the effect and possible mechanism of Shenque(CV8) moxibustion therapy on the mice with autoimmune thyroiditis.MethodsExperimental autoimmune thyroiditis(EAT) model was replicated on mice with high iodine intake and subcutaneous immunization of porcine thyroglobulin (PTg). The mice were randomly divided into blank group, EAT model group and treatment group. The thyroid stimulating hormone (TSH)concentrations and thyroglobulin antibody (TGAb)concentrations were detected by enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). The morphological changes of thyroids and local skin tissues around CV8 were observed by HE staining. The expression of cytokine transforming growth factor- β1 (TGF- β1) and transient receptor potential vanilloid subfamily member 1 (TRPV1) of thyroid tissues and local skin tissues around CV8 were detected by immunohistochemistry (IHC).ResultsComparing with the EAT model group, the mice from treatment group presented lighter congestion, swollen and inflammatory cells infiltration, degeneration and necrosis of follicular epithelial cells in thyroid tissues, along with normal production of thyroglobulin. The expression of TGF- β1 and TRPV1 in the local skin tissues around CV8 were enhanced significantly after treatment(P<0.05), however, there were no significant changes in the thyroid tissues(P>0.05). The serum TGAb concentrations of treatment group were significantly lower comparing with the EAT model group(P<0.05), however, there was no significant differences in the serum TSH concentrations among groups(P>0.05).ConclusionUsing Moxibustion therapy on CV8 can significantly ease the inflammation in the thyroid tissues of EAT mice. The up regulation of TGF- β1 and TRPV1 in the local skin tissues around CV8 after moxibustion therapy may suppress the immune response, moreover, causing a down regulation of thyroid autoantibody.

experimental autoimmune thyroiditis; Shenque(CV8); moxibustion; mice

2017- 04- 17

2017- 06- 11

国家自然科学基金资助项目(81603695)

陈若暘(1991-)，女，江苏南京人，在读硕士研究生。E- mail：cathy1510@sina.com

高建芸 E- mail：gaotcm@163.com

陈若暘，高建芸，苏方方，等. 神阙灸法治疗EAT模型小鼠的疗效及机制初探.东南大学学报:医学版,2017,36(5)：752- 757.

R581.4； R33- 33； R254.8

A

1671- 6264(2017)05- 0752- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.013

(本文编辑：何彦梅)