哮喘患者外周血单个核细胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表达及临床意义

杨丽霞 董琼 蒋莉 何大川 高菡 谢勇

哮喘患者外周血单个核细胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表达及临床意义

杨丽霞 董琼 蒋莉 何大川 高菡 谢勇

目的检测外周血单个核细胞TLR4mRNA及NF-κBmRNA在哮喘患者中的表达，探讨其在哮喘发病机制中的作用以及临床意义。方法选取80例确诊哮喘患者，根据哮喘分级标准，分为急性发作组(A组)和慢性持续期组(B组)，每组40人，经治疗症状体征好转后，分别作为临床缓解期组，选取同期健康体检者40例作为健康对照组(C组)，应用RT-PCR法检测PBMC中TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表达，应用ELISA法检测血清IL-6的表达水平。结果A组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达均明显高于B组(P<0.05)。A组和B组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表达均明显高于C组(P<0.05)。A组和B组哮喘患者经治疗后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达明显低于治疗前，且高于C组(P<0.05)。哮喘患者TLR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6三者的表达相成正相关(P<0.05)。结论TLR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6共同参与了哮喘的发生和发展，三者可能存在于同一传导通路。

哮喘；TLR4mRNA；NF-κBmRNA；IL-6

支气管哮喘是一种以嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种细胞和细胞因子浸润的慢性气道炎症性疾病，世界卫生组织(WHO)调查显示，目前全世界约有2亿哮喘患者，其中有1500万丧失劳动力[1]。Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)是模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)中的重要成员，在固有免疫机制中可以传导炎症信号，并能够识别病原相关的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMP)，从而激活单个核细胞因子-κB，引发一系列的信号传导，导致大量细胞因子、趋化因子、黏附分子等炎性介质的释放[2-3]。本研究旨在探讨 TLR4mRNA及NF-κBmRNA的表达在哮喘患者中的临床意义，并分析其相关性。

资料与方法

一、研究对象及分组

选取2015年10月至2016年8月期间在本院确诊的哮喘患者80例。其中男性42例，女性38例，年龄19-74岁，平均(57.3±7.5)岁。根据《支气管哮喘防治指南》对哮喘的分级标准[4],分为A组和B组。A组为急性发作期患者40例，其中男性21例，女性19例，患者年龄19-73岁，平均(53.1±7.2)岁；B组为慢性缓解期患者40例，其中男性20例，女性20例，年龄20-76岁，平均(58.4±7.3)岁；急性发作前患者治疗后症状和体征好转，作为临床缓解期组。C组为健康对照组40例，均为随机同期在我院体检中心的健康体检者，年龄为18-75岁。平均年龄为(55.6±6.8)岁。所有入选者2周内未使用糖皮质激素，除外高血压、糖尿病、肿瘤等疾病。三组受试者在性别、年龄上无明显差异(P>0.05)。

二、主要试剂

人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)，Trizol试剂(TakaRa公司，JAPAN)，实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TakaRa公司, JAPAN)，荧光染料试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix(TakaRa公司,JAPAN)，人IL-6定量ELISA试剂盒 (neobiosciense公司，中国)。

三、标本采集

采集外周静脉血5 mL，EDTA抗凝后进行离心。应用人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司，中国)分离出PBMC，血清及PBMC分别保存于-20℃备用。

四、RT-PCR检测TLR4mRNA及NF-κBmRNA RT-PCR的表达

提取RNA，并按逆转录试剂说明书建立反应体系，总体积为20 μL。反应条件(40个循环)：95℃10 min，95℃15 s。60℃ 1 min。每份标本作复孔，复孔间Ct值差异控制在0.5内。应用2-△△Ct值相对定量法，对后期数据进行处理。

五、 ELISA法检测IL-6的表达

应用IL-6ELISA试剂盒，严格按照说明书进行操作，检测各组血清中IL-6的浓度。

六、统计学方法

结 果

一、 A组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达均明显高于B组(P<0.05)。A组和B组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表达均明显高于C组，P<0.05，。(见表1)。

表1 各组TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达

二、A组和B组哮喘患者经治疗后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达明显低于治疗前，且高于C组，P<0.05，(见表2)。

表2 哮喘治疗前后TLR4mRNA、NF-κBmRNA的水平及IL-6表达

三、哮喘患者TLR4mRNA与NF-κBmRNA的表达成正相关，相关系数r=0.73，P<0.05；哮喘患者TLR4mRNA与IL-6的表达成正相关，相关系数r=0.76，P<0.05;哮喘患者NF-κBmRNA与IL-6的表达成正相关，相关系数r=0.84，P<0.05。(见表3)。

表3 TLR4mRNA、NF-κBmRNA的水平及IL-6表达三者的相关性研究

#P<0.05 表示相关性显著

讨 论

支气管哮喘是一种内源性和外源性免疫系统共同作用所致的变态性炎症，气道壁结构出现异常改变以及气道高反应性是其主要特点，随着对哮喘的研究不断深入，我们逐渐更加关注哮喘炎症的机制[5]。TLR4的生物结构模式是一种I型跨膜受体蛋白，表达于CD14阳性的细胞，也表达于CDl4阴性的细胞，它主要由三个部分组成：胞外结构区、跨膜结构段和胞内结构区。环境中的许多变应原，比如屋内尘螨(HDM)、病毒感染、内毒素都能够与机体的PRRs结合，而屋尘螨(HDM)是TLR4的主要配体之一，机体TLR4识别环境中的HDM后，可以激活胞内NF-κB及相关蛋白激酶，进一步释放相关的细胞因子，如IL-6，IL-8等，IL-6是趋化因子家族中的一员，其生物效应极为广泛，具有调节细胞增殖、细胞分化、免疫防御机制等多种功能[6-7]。

本研究数据显示，A组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达均明显高于B组(P<0.05)。A组和B组患者的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6的表达均明显高于C组(P<0.05)。这充分证实了TLR4mRNA、NF-κBmRNA的及IL-6均参与了哮喘的发病，并且在哮喘的急性发作期具有更显著的表达。国外[8]研究发现TLR4不仅能够激活下游炎症传导，还参与了多种细胞的迁移，与哮喘密切相关，同我们的研究结果一致。本研究还发现，A组和B组哮喘患者经治疗后的TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达明显低于治疗前，且高于C组(P<0.05)。说明TLR4mRNA及NF-κBmRNA的水平及IL-6表达和病情的严重程度具有相关性，因此，可能成为衡量哮喘严重程度的重要指标。而IL-6作为一种发现较早的炎症因子，其在哮喘中的意义和价值已经得到了广泛认同[9],但是TLR4mRNA及NF-κBmRNA在哮喘患者中的临床价值，仍需要大样本的研究继续探索。此外，在相关性分析中我们发现，哮喘患者LR4mRNA、NF-κBmRNA及IL-6三者的表达均成正相关，提示我们，三者或许在同一传导途径，其机制可能是当机体受到外界环境中的变应原的刺激，可引起机体的免疫应答和炎症反应，激活TLR4/NF-κB分子途径，从而诱导释放炎症信号，促进IL-6等炎症因子的释放。Hammad[10]等通过嵌合子小鼠模型实验，认为TLR4表达于呼吸道上皮表面，其可介导上皮细胞和气道内DCs相互作用，诱导机体各类变态反应，激活NF-κB传导通道，而Toledo 等[11]在哮喘小鼠中的研究发现，二氢黄酮类能够抑制NF-κB 的表达，减少促炎细胞因子的合成和释放，阻断哮喘的瀑布式炎症反应，这进一步证实了我们的推论。

综上所述，TLR4/NF-κB参与了哮喘的发生和发展，并通过一系列的信号传导，诱导其他炎症因子的释放，进一步加重哮喘的炎症反应，因此，阻断外界致敏性刺激对TLR4的激活或者阻断TLR4/NF-κB传导途径，可能为哮喘的防治提供新的思路，值得我们继续探索。

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[2] Miyata R,van Eeden SF.The innate and adaptive immune response induced byalveolar macrophages exposed to ambient particulate matter[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,257(2):209-226.

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[11] Toledo AC,Sakoda CP,Perini A,et al.Flavonone treatment reverses airway inflammation and remodelling in an asthma murine model[J].Br J Pharmacol,2013,168(7):1736-1749.

ExpressionandclinicalsignificanceofTLR4mRNAandNF-κBmRNAinperipheralbloodmononuclearcellsofasthmapatients

YANGLi-xia,DONGQiong,JIANGLi,HEDa-chuan,GAOHan,XIEYong

DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchongCentralHospital,Nanchong,Jiangsu637000,China

ObjectiveTo examine the expression of TLR4mRNA and NF-κBmRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of asthma patients and to study their roles in the pathogenesis of asthma as well as their clinical significance.Methods80 asthma patients were involved and they were divided into the acute attack group (the group A) and the chronic duration group (the group B) based on clinical classifications of asthma, and each group had 40 patients. After treatment, the improvement in symptoms and physical signs was observed. 40 healthy individuals were selected as the control group (the group C). RT-PCR was used to examine the expressions of TLR4mRNA and NF-κBmRNA in PBMC, and ELISA was applied to detect the expression of serum IL-6.ResultsTLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 had significantly higher expressions in the group A than in the group B (P<0.05). The expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 in the group A and the group B were significantly higher than in the group C (P<0.05). In addition, after treatment dramatic falls were observed in the expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 in the group A and the group B which were still higher than those of the group C (P<0.05). The expressions of TLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 showed positive correlations (P<0.05).ConclusionTLR4mRNA, NF-κBmRNA and IL-6 are all responsible for the pathogenesis of asthma and they are may exist in the same pathway.

asthma; TLR4mRNA; NF-κBmRNA; IL-6

2017-02-04]

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.019

637000 四川 南充，南充市中心医院呼吸内科