阿拉尔地区枣园不同时期枣花、枣果黑斑病菌带菌量检测

许 瑛，姚兆群，王 兰，谢建明，赵思峰

(1.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003；2.塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团第十三师红山农场， 839202)

阿拉尔地区枣园不同时期枣花、枣果黑斑病菌带菌量检测

许 瑛1，姚兆群1，王 兰2，谢建明3，赵思峰1

(1.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003；2.塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团第十三师红山农场， 839202)

目的检测新疆南疆阿拉尔市枣园不同时期枣花、枣果上黑斑病菌的带菌量，确定枣果黑斑病的侵入时期和侵入部位，明确防治该病害的关键时期。方法在阿拉尔市周边3个枣园分别采集不同时期的枣花、枣果，采用常规组织分离法对其进行分离，并对分离物进行鉴定，用交链格孢菌特异性引物采用实时荧光定量PCR方法，检测不同时期枣花及枣果各部位带菌量。结果在不同时期采集的枣花及枣果各部位均分离到了链格孢菌，累计获得276个分离物，经鉴定均为A.alternata；实时荧光定量PCR检测表明，在枣花上就能检测到枣果黑斑病菌，其平均含量为2.11 μg/100 mg，在栆果上果肉中链格孢菌含量最高，其中胴部果肉含量最高为20.12 μg/100 mg，果柄处果肉为9.34 μg/100 mg，胴部果皮11.48 μg/100 mg，果柄处果皮为3.84 μg/100 mg。结论枣果黑斑病菌在红枣开花期就可以感染枣花，病菌可在枣果果肉中大量潜伏侵染，待黑斑病显症时，果肉中已有大量病菌存在，对枣果黑斑病的药剂防治应提前至红枣开花前期。

枣果黑斑病；链格孢菌；RT-PCR；枣花和枣果

0 引 言

【研究意义】新疆南疆地区光热资源丰富，气候干燥，为优质红枣生产提供了良好条件[1]，目前已成为我国最重要的商品枣生产基地[2-3]。近年来，枣果黑斑病在南疆红枣种植区普遍发生，因枣农不清楚该病害病原菌的侵入部位和侵入时期，在栆果上出现黑斑后才开始防治，使得防治效果不佳，通常可造成10%～60%的减产，且多次用药也易导致栆果中产生农药残留[4]。检测新疆南疆阿拉尔市枣园不同时期枣花、枣果上黑斑病菌的带菌量，研究枣果黑斑病的侵入时期和侵入部位，对明确防治该病害的关键时期有重要意义。【前人研究进展】已有大量文献报道导致枣果黑斑病的病原菌与链格孢属真菌密切相关，其中南疆枣区黑斑病的致病菌主要为A.alternata[4-7]，该菌可在枣树芽鳞、皮痕[8]、老树皮、田间病残体、落叶、枣园周边沙枣林等[9-10]场所越冬，其对枣树叶片、枣花和果实均可以侵染[4,11]，且可能存在潜伏侵染和再次侵染现象[12]。但该菌何时侵入栆果以及从什么部位侵入栆果等问题一直没有明确，对及时防治该病造成了一定困难。采用常规组织分离和显微镜观察等方法难以做到对链格孢菌进行定量检测，Real-time PCR是一种快速检测、定量分析的分子检测技术，具有操作简单，检测迅速，准确灵敏等优点，近年来在植物真菌病害的快速诊断和防控工作中发挥了重要作用[13]，已在棉花黄萎病菌[14]、小麦纹枯病菌[13]、土壤中禾谷丝核菌[15]、苹果牛眼果腐病菌[16]等真菌病害检测中应用广泛，王凤军等[17]已建立了枣褐斑病菌实时荧光PCR快速检测方法。【本研究切入点】已明确了A.alternata可以侵染枣树叶片、枣花和栆果，然而该菌何时侵入枣花和栆果，是否存在潜伏侵染等问题尚未明确。研究枣园不同时期枣花、枣果黑斑病菌带菌量并检测。【拟解决的关键问题】不同时期采集阿拉尔市周边枣树上的枣花和枣果进行组织分离和病原鉴定，并通过链格孢菌特异性引物，采用实时荧光定量PCR的技术检测不同时期枣花及枣果各部位的带菌量，明确栆果黑斑病初侵染时期和侵入部位，确定枣果黑斑病的防治关键时期。

1 材料与方法

1.1 材 料

在第一师阿拉尔市农科所枣园、10团7连(2块地)共三个供试枣园采集枣花和枣果，这3块枣园历年均有黑斑病发生。在3块枣园中各选择3株枣树定点采样，从枣花、枣果黑斑病显症前期到显症初期，每3 d采集1次样品，每次采集枣花60朵，枣果30颗，三个枣园各采集枣花11次样品、枣果10次样品。从每次采集的枣花中随机挑选30朵，枣果随机挑选15颗进行常规组织分离，并对分离获得的分离物进行形态学和分子生物学鉴定，确定病原种类，剩余枣花、枣果用于链格孢菌的实时荧光定量PCR检测。

实时荧光定量PCR参照菌株镰刀菌(Fusariumsp.)、杨树腐烂病菌(V.mali)为石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室保存，苹果黑斑病链格孢菌(Alternariasp.)为塔里木大学植物科学院植物病理研究室分离保存。

1.2 方 法

1.2.1 枣花枣果分离及病原鉴定

1.2.1.1 病菌分离及形态学鉴定

按照常规组织分离法对采集的10次样品中300朵枣花150颗枣果进行分离[18]，取枣花、枣果(去枣皮)病健交界处0.5 mm组织块，先用75%乙醇消毒1 min，再用1 g/L HgCl2浸泡40 s，然后用无菌水冲洗3次、晾干，移置PDA培养基平板，25℃培养。当培养2～3 d后，组织边缘开始长出菌丝，挑取少量菌丝转至新PDA培养基，待菌落长3 d后在WA培养基上进行单孢纯化培养。纯化后获得的分离物保存在试管PDA斜面上，用于后续形态学鉴定。将纯化的分离物在PDA上28℃培养5 d后，打直径为5 mm菌饼，放置在PCA平板上，在菌饼边缘放置一片无菌盖玻片。28℃培养3～5 d，待盖玻片表面长满菌丝后，将其放置于载玻片上，在光学显微镜下观察产孢结构、孢子形态等特征并拍照。根据菌落特征、产孢表型和分生孢子的形态特征，参照《中国真菌志:链格孢菌》进行属和种的初步鉴定[19]。

1.2.1.2 链格孢菌分子生物学鉴定

选取上述分离获得的代表菌株接种于转至PDA平板上，28 ℃的培养3～5 d，刮取少量菌丝体至1.5 mL PE管中，使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。选用β-tubulin(Beta-F：CAGCTCGAGCGTATGAACGTCT和Beta-R：CGGAAGTCGGAAGCAGCCATC)及EF-1α(EF1-728F：CATCGAGAAGTTCGAGAAGG和EF1-986R：RTACTTGAAGGAACCCTTACC)两条引物进行PCR扩增[20-21]。反应完成后，各扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物纯化后送去测序。序列结果登陆到NCBI中BLAST进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，使用MEGA 5.1软件中邻接法(NJ)构建系统发育树。

1.2.2 链格孢菌实时荧光定量PCR检测

1.2.2.1 供试菌株DNA提取

取上述分离鉴定的枣果黑斑病链格孢菌株的菌丝100 mg作为阳性对照，使用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，同时提取镰刀菌(Fusariumsp.)、杨树腐烂病病原菌(V.mali)、苹果黑斑病链格孢菌(Alternariasp.)的DNA作为对照。DNA提取后检测DNA浓度，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2.2 引物特异性检测

枣果黑斑病链格孢菌特异性引物设计参考王凤军[17]设计的引物，即Alta1基因引物，F-AltAA：TGTTCCCTTGGTGGGTTCG和R-AltAa：GCATTTCGCTGCGTTCTTC。PCR扩增反应体系为：PCRTaqMix 12.5 μL，10 μmol/L F-AltAA/F-AltAa 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，至终体积为25 μL体系。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，59℃退火20 s，72℃延伸，72℃延伸10 min，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。Real-time PCR 反应体系：SYBR PCR premix 5 μL，引物各0.25 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 3.5 μL，共10 μL体系。反应条件：第一步，94℃预变性5 min；第二步，94℃1 min，59℃ 20s，72℃1 min，共40个循环；72℃延伸10 min；熔解曲线：95℃ 30 s，55℃ 15 s，95℃ 15 s。

1.2.3 枣花、栆果中链格孢菌含量检测

1.2.3.1 发病枣花、枣果DNA提取

取不同时期的枣花采集的100 mg和枣果(果柄果皮、果柄果肉、胴部果皮、胴部果肉)4个部位的植物组织材料各100 mg。使用植物基因组DNA提取试剂盒提取各样品DNA，最终获得的DNA均使用50 μL TE洗脱2次，放置在-20℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 质粒标准品的制备及标准曲线建立

将链格孢菌阳性菌株PCR产物直接与pMD19-T Vector 链接，16℃过夜；取链接产物5 μL通过热击转化至DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养。挑取单个阳性克隆于LB液体培养基中(含AMP抗性)，37℃，200 r/min 振荡培养过夜。菌液测序，使用质粒提取试剂盒，从上述阳性转化菌中提取重组质粒，测定质粒DNA浓度。将上述提取质粒DNA按照测定浓度进行10倍递增梯度稀释，进行荧光PCR检测。以拷贝数的对数值为x轴，以Ct值为y轴，构建RT-PCR标准曲线。计算公式：拷贝数/mL=6.02×1023(拷贝数/mol)×重组质粒浓度(g/mL)/MW(g/mol)。其中MW(重组质粒分子质量)=(目的基因碱基对数+载体碱基对数)bp×660 daltons/base pair计算重组质粒拷贝数，即目的基因的拷贝数。

1.2.3.3 枣果黑斑病菌数量与目的基因拷贝数的线性方程绘

将上述提取的链格孢阳性菌株(100 mg菌丝)DNA，按照10倍递增梯度稀释后，进行荧光PCR检测，将得到的Ct值代入1.2.3.2重组质粒的标准曲线中，获得目的基因拷贝数的Lg值。以枣果黑斑病链格孢菌数量的 Lg值为横坐标，目的基因拷贝数的Lg值为纵坐标，用 Excel 软件绘制线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 枣花、枣果上链格孢菌鉴定

2.1.1 链格孢菌的形态鉴定

对300朵枣花、150颗枣果进行了分离，共获得276个分离物，分离物单胞纯化后，观察病原菌的菌落形态、颜色、质地等性状。选取了20株具有代表性菌株，观察形态，枣花、枣果中分离出的病原物相同，根据形态特征及孢子形态，在PDA平板上菌落形态呈边缘整齐的圆形，菌落初期白色后期颜色加深呈灰色，菌丝呈棉絮状(图1A，图1B)。在PCA平板上26℃下培养5～7 d，可产生淡褐色的分生孢子和5～9个孢子组成的孢子链，分生孢子梗合轴分支产孢或者不分支产孢(图1C)。分生孢子单生，呈倒棍棒状或倒梨形，淡褐色，具3～6个横隔膜和0～2个纵隔膜或斜隔膜，同时参照《中国真菌志:链格孢属》，初步鉴定枣花、枣果病原菌为A.alternata[19]。图1

2.1.2 链格孢菌的分子鉴定

使用EF-1α和β-tubulin引物对枣花、枣果中分离的病原菌的DNA进行PCR扩增，两组引物分别获得大小约为250 bp、800 bp左右清晰条带。选取枣花黑斑病代表菌株(NKSXY-H3、NKSXY-H4)和枣果黑斑病代表菌株(NKSXY-Z3、NKSXY-Z4)的扩增产物纯化测序。将测得的序列登陆NCBI中BLAST同源性比较。EF-1α构建的系统发育树与已经登录菌株A.tenuissima和A.alternata聚在一个分支上。枣果黑斑病的代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4与A.alternata(KU145273.1)亲缘关系较近，支持率为99%。枣花代表菌株NKSXY-H3、NKSXY-H4与A.tenuissima(KU145274.1)和A.alternata(KJ008705.1)亲缘关系较近，支持率为99%，但代表菌株与其他链格孢种不在一个分支上。β-tubulin构建的系统发育树可知枣果黑斑病的代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4和枣花黑斑病代表菌株NKSXY-H3、NKSXY-H4与A.alternata(KJ008679.1)、A.alternata(KF680870.1)聚在一个亚分枝上，支持率达到99%，表明代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4、NKSXY-H3、NKSXY-H4与A.alternata亲缘关系最近。综合形态学鉴定及分子生物学鉴定结果，确定感病枣花、枣果中病原菌为A.alternata。图2，图3

A～B：PDA培养基上菌落形态，C～D：PCA培养基上分生孢子梗及分生孢子

A-B: Colony morphology on PDA,C-D:Conidiophores and conidia on PCA

图1 红枣果黑斑病病原菌形态学鉴定
Fig.1 Morphology of pathogen causing jujube black spot

图2 基于EF-1α 构建的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree based on EF-1α gene sequences of representative strains

图3 基于β-tubulin序列构建的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree based on β-tubulin gene sequences of representative strains

2.2 荧光定量PCR检测

2.2.1 引物特异性验证

利用链格孢菌的特异性引物F-AltAA和F-AltAa分别扩增枣果黑斑病(A.alternata)、苹果黑斑病(Alternariasp.)、镰刀菌(Fusariumsp.)、杨树腐烂病菌(V.mali)中提取的DNA。仅在枣果中分离出来的链格孢菌扩增出了单一清晰明亮的条带，其它供试菌株均无条带，证明该引物可作为枣果黑斑病链格孢菌的特异性引物用于后续荧光定量检测。图4

注：M: Marker(200bp)泳道；1:水；2:镰刀菌；3:杨树腐烂病菌；4:苹果黑斑病菌；5:枣果黑斑病菌

Note:M: Marker(200bp) Lane； 1:water； 2:Fusariumsp. ； 3:V.Mali； 4:Alternariasp. ； 5:A.alternata

图4 引物特异性荧光定量检测
Fig.4 The PCR validation test of specific primer

2.2.2 重组质粒荧光定量PCR标准曲线的建立

将1.2.3.2制备的质粒标准品按浓度梯度稀释，重组质粒初始浓度为15 ng/μL。计算质粒拷贝数，以拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标构建标准曲线为y= -3.114x+32.794，相关系数R2=0.991 4。其线性关系良好，可用于枣果黑斑病链格孢菌定量检测。图5

2.2.3 枣果黑斑病菌数量与目的基因拷贝数的线性方程

将上述100 mg链格孢菌丝中提取的DNA，进行10倍梯度稀释，发现其CT值重复性较好。根据质粒标准曲线y= -3.114x+32.794把该CT值转换为目的基因拷贝数的Lg值。再根据链格孢菌菌量的Lg值(x)与其目的基因拷贝数的Lg值(y)建立线性回归方程y=0.975 8x+0.798 9，R2=0.967 1。其线性关系良好，可用于枣果黑斑病链格孢菌定量检测。图6

图5 重组质粒 RT-PCR 标准曲线
Fig.5 Standard curve for recombinant plasmid of RT-PCR

图6 链格孢菌数量与目的基因拷贝数回归曲线
Fig.6 Regression curve for A.alternata and target genecopy number by RT-PCR

2.2.4 枣果中各部位链格孢菌PCR检测

将1.2.3.1提取的DNA模板，先通过链格孢菌特异性引物F-AltAA/F-AltAa PCR验证发现，枣花、枣果(果柄果皮、果柄果肉、胴部果皮、胴部果肉)提取的DNA只有一部分可以扩增出大小约140 bp片段，说明这些泳道所对应的样品中有链格孢菌A.alternata。未检测到的样品可能与随机取样和链格孢菌含量有关，对能扩增出条带的样品和随机部分未扩增出条带的可以检测到浓度的样品进行下一步荧光定量检测。图7

注：M: Marker(200 bp)；1～4:胴部果肉；4～8:胴部果皮；9～12:果柄果肉；13～16:果柄果皮；17～19:枣花

Note:M: Marker(200bp)Lane；1-4: bottom flesh； 4-8: bottom peel； 9-12: carpopodium flesh； 13-16:carpopodium peel； 17-19:flower

图7 特异引物扩增枣花、枣果结果
Fig.7 The PCR results of specific primer

2.2.5 枣花和枣果不同部位链格孢菌量的动态检测

5月18日采集样品中就能检测到病菌存在，其含量为0.83 μg/100 mg，随着开花期的延长，链格孢菌检测量越来越高，6月17日枣花外观明显发黑(图8C)，此时菌量达到了4.25 μg/100 mg(图9)。尽管枣果上没有表现任何症状，但从8月18日就可在胴部果肉、胴部果皮、顶端果肉和顶端果皮检测到链格孢菌，其中胴部果肉中的菌量可达8.32 μg/100 m，胴部果皮为3.06 μg/100 m，顶端果肉和顶端果皮中菌量较少。随着枣果逐渐成熟，枣果各部位的带菌量不断增加，到9月14日时，胴部果肉中菌量达到34.98 μg/100 m，果皮达到22.67 μg/100 m，在红枣外观看到的是一个小黑斑，但内部果肉已经大片发黑(图10A，图10B)，顶端果肉和顶端果皮的链格孢菌也有大量积累(图11)。图8～11

A：健康枣花；B：发病初期；C发病后期

A: Jujube flowers; B: The initial stage symptom of flowers; C: The later stage symptom of flowers

图8 枣花黑斑病症状
Fig.8 Black spot disease symptoms of jujube flower

图9 不同时期采集的枣花中链格孢菌菌量
Fig.9 The hyphae amount of A.alternata jujube flowers in different periods

A：胴部发病初期；B：胴部果肉；C：果柄

A: Initial stage symptoms of bottom; B: bottom flesh; C: Jcarpopodium

图10 枣果黑斑病症状
Fig.10 Black spot disease symptoms of jujube fruit

图11 不同时期采集的枣果中各部位链格孢菌菌量
Fig.11 The hyphae amount of A.alternata in different parts of jujube fruit collected in different periods

3 讨 论

枣果黑斑病已成为南疆枣园重要的病害，近几年给南疆红枣产业造成了很大影响，该病主要是在红枣红熟期开始普遍显症，随着红枣成熟度不断增加，黑斑病逐渐加重，广大枣农通常是在枣果上出现黑色斑块后开始打药，所用药剂既有杀细菌的，也有杀真菌的，还有喷施微肥的，然而各种方法防效均不好。此次研究结果进一步证明了链格孢菌A.alternata既可以感染枣花，也可以感染枣果，这与孙洁[11]等、董宁[4]等认为危害枣叶、枣花和果实病原菌为同一种致病菌A.alternata的结果相一致，因此枣果黑斑病用药应以杀真菌剂为主，可辅助喷施微肥以提高枣果抗病性。

目前，主要通过常规的组织分离、实时荧光PCR检测、GFP标记的方法检测病菌侵入及分布，李菲菲等[22]通过组织分离法确定了柑橘炭疽病菌在柑橘花器和果实上的带菌率。肖蕊等[14]通过实时荧光PCR检测了棉花黄萎病菌。贾娜娜等[23]通过GFP标记确定了梨腐烂病菌侵入及扩展情况。而这几种检测方法在红枣黑斑病中的报道较少，王凤军等[17]仅建立了枣果褐斑病菌荧光定量PCR检测方法，并没有做深入研究。而研究在荧光定量PCR基础上，通过绝对定量的方法检测了不同时期采集的枣花、枣果不同部位中链格孢菌的含量，检测结果表明，链格孢菌可以侵染枣花，造成枣花发病，也可以感染枣果，尽管枣果表皮上看不到黑斑病的症状，但在果肉和果皮中已经能够检测到链格孢菌的存在，病原菌可以在果肉中潜伏侵染，待枣果转色糖分积累期病菌数量迅速增加并显症，若遇到合适的温度和湿度，病害开始爆发，等枣农看到显症后开始用药，已经无法控制病害的发生，因此对枣果黑斑病的防治时期，应当提前至红枣开花前将病原菌初次侵染量减下来，枣果膨大期减少再次侵染，从而达到较好控制枣果黑斑病的效果。

4 结 论

对田间发病枣花、枣果上病原菌进行分离鉴定表明，不同时期采集的枣花、枣果上侵染的病原菌均为链格孢菌A.alternata。实时荧光定量PCR检测结果表明，在枣花、枣果各部位均检测到了链格孢菌，并且随着时间的增加病原菌数量不断增加，病原菌在枣果果肉中存在潜伏侵染的情况。对枣果黑斑病的防治，应提前至红枣开花前或开花初期，所用药剂为杀真菌剂。

References)

[1] 王兰，冯宏祖，熊仁次，等．新疆红枣病虫害发生现状及对策[J]．中国植保导刊，2014，34(6)：73-75．

WANG Lan, FENG Hong-zhou, XIONG Ren-ci, et al. (2014). Situation and countermeasures on pests and disease of jujube in Xinjiang [J].ChinaPlantProtection, 34(6):73-75.(in Chinese)

[2]向征，钟聪慧，黄家风，等．新疆枣树实生苗枯萎病病原鉴定[J]．植物保护学报，2014，41(2)：253-254．

XIANG Zheng, ZHONG Cong-hui, HUANG Jia-fen, et al. (2014). Identification of thepathogen ofFusariumwilt of jujube seedlings in southern Xinjiang [J].JournalofPlantProtection, 41(2):253-254. (in Chinese)

[3]Xinwen, Xuedong, Zheng, & Zhenjiang. (2015). Current development situations of ziziphus jujuba industry in south xinjiang and recommendations.AsianAgriculturalResearch, (4):37-41.

[4]董宁，冯宏祖，王兰，等．南疆骏枣黑斑病症状表现及病原菌鉴定[J]．植物保护学报，2016，43(6)：922-927．

DONG Ning, FENG Hong-zu, WANG Lan, et al. (2016). The disease symptom and the pathogen identification of jujube black spot in southern Xinjiang [J].JournalofPlantProtection, 43(6):922-927.(in Chinese)

[5]向征，钟聪慧，胡军，等．新疆枣果黑斑病病原鉴定[J]．新疆农业科学，2013，50(5)：845-850．

XIANG Zheng, ZHONG Cong-hui, HU Jun, et al. (2013). Identification of jujube black spot pathogens in Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 50(5):845-850.(in Chinese)

[6]郭东起，蒋卉，牛宁宁，等．南疆骏枣黑斑病病原菌的分离、鉴定及控制研究[J]．中国植保导刊，2015，35(12)：5-8，85．

GUO Dong-qi, JIANG Hui, NIU Ning-ning, et al. (2015). Separation and identification of jujube black spot pathogens and its controlling in southern Xinjiang [J].ChinaPlantProtection, 35(12):5-8,85.(in Chinese)

[7]包慧芳，王宁，侯敏．新疆红枣黑斑病病原菌鉴定及拮抗细菌筛选[J]．新疆农业科学，2016，53(9)：1 667-1 673．

BAO Hui-fang, WANG Ning, HOU Min. (2016). Identification of the pathogen and screening of the antogonistic bacteria of jujube black spot disease in Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 53(9):1,667-1,673.(in Chinese)

[8]吴玉柱，季延平，刘慇，等．冬枣黑斑病发生规律的研究[J]．山东林业科技，2004，(3)：1-3．

WU YU-zhu, JI Yan-ping, LIU Yin, et al. (2004). The study on outbreak regularity of black patch disease in cv. Dongzao jujube [J].ShandongForestryScienceandTechnology, (3):1-3.(in Chinese)

[9]陈小飞，熊仁次，徐崇志，等．红枣黑斑病研究现状与展望[J]．黑龙江农业科学，2013,(10)：141-144．

CHEN Xiao-fei, XIONG Ren-ci, XU Cong-zhi, et al. (2013). Current situation and prospect on jujube black spot disease [J].HeilongjiangAgriculturalSciences, (10):141-144.(in Chinese)

[10]马荣，刘晓琳，梁英梅，等．新疆枣果黑斑病发生规律及温湿度对其的影响[J]．植物保护学报，2016，43(5)：805-811．

MA Rong, LIU Xiao-lin, LIAN Ying-mei, et al. (2016). The growth and decline regularity of jujube black spot pathogen and the influence of temperature and humidity in Xinjiang [J].JournalofPlantProtection, 43(5):805-811.(in Chinese)

[11]孙洁，池振江，赵思峰，等．新疆南疆红枣花腐病病原鉴定[J]．西北农业学报，2014，23(2)：176-180．

SUN Jie, CHI Zhen-jian, ZHAO Si-feng, et al. (2014). Identification of pathogen causing flower rot on jujube in southern Xinjiang [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica, 23(2):176-180. (in Chinese)

[12]符泽．新疆阿拉尔垦区矮化密植枣园红枣黑斑病发病规律的初步研究[D]．石河子: 石河子大学硕士学位论文，2015．

FU Ze. (2015).PreliminarystudyonincidenceregulationofblackspotdiseaseofjujubeinreclamationareaofAlar[D]. Master Thesis. Shihezi University, Shihezi.(in Chinese)

[13]孙炳剑，陈清清，袁虹霞，等．SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用[J]．中国农业科学，2015，48(1)：55-62．

SUN Bin-jian, CHEN Qing-qing, YUAN Hong-xia, et al. (2015). Establishment of SYBR green I real-time PCR for quantitatively detecting rhizoctonia cerealis in winter wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica, 48(1):55-62.(in Chinese)

[14]肖蕊，余真真，Elsharawy A A，等．土壤中棉花黄萎病菌SYBR Green I荧光RT-PCR定量检测技术研究[J]．菌物学报，2011，30(4)：598-603．

XIAO Rui, YU Zhen-zhen, Elsharawy A A, et al. (2011). SYBR green I real time RT-PCR assay for quantitatively detecting the occurrence ofVerticilliumdahliaeof cotton in naturally infested soil [J].Mycosystema, 30(4):598-603.(in Chinese)

[15]Guo, Y., Li, W., Sun, H., Wang, N., Yu, H., & Chen, H. (2012). Detection and quantification of rhizoctonia cerealis, in soil using real-time PCR.JournalofGeneralPlantPathology, 78(4):247-254.

[16]林惠娇，王卫芳，易建平，等．TaqMan探针实时荧光PCR快速检测苹果牛眼果腐病菌方法的建立[J]．植物检疫，2016，30(2)：55-62．

LIN Hui-qiao, WANG Wei-fang, YI Jian-ping, et al. (2016). Development of TaqMan probes real-time fluorescence PCR method for the rapid detection of the causal fungal agents of bull's-eye rot on apple [J].PlantQuarantine, 30(2):55-62.(in Chinese)

[17]王凤军，张祥林，谭志文，等．枣褐斑病菌实时荧光PCR快速检测方法研究[J]．食品工业科技，2014，35(14)：56-58，63．

WANG Feng-jin, ZHANG Xiang-lin, TAN Zhi-wen, et al. (2014). Real-time fluorescence PCR method for detection of the pathogen causing brown spot on jujube [J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry, 35(14):56-58,63.(in Chinese)

[18]方中达．植病研究方法[M]． 第3版. 北京：中国农业出版社，1998．

FANG Zhong-da. (1998).Researchmethodsofplantpathology[M]. 3rd edition. Beijing: China Agriculture Press.(in Chinese)

[19]张天宇．中国真菌志：链格孢属[M]．北京：科学出版社，2003．

ZHENG Tian-yu. (2003).Chinesefungi:Alternaria[M]. Beijing: Science Press. (in Chinese)

[20]王勇．细基格孢属、葡柄霉属及其近似属的形态学与分子系统学的研究[D]．泰安：山东农业大学博士学位论文，2010．

WANG Yong. (2010).MorphologicalandmolecularphylofeneticstudiesofUlocladium,Stemphyliumandalliedgenera[D]. PhD Thesis. Shandong Agricultural University, Tai'an. (in Chinese)

[21]Carbone, I., & Kohn, L. M. (1999). A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes.Mycologia, 91(3):553-556.

[22]李菲菲，龙超安．柑橘炭疽病菌的分离、鉴定及在果实上的潜伏侵染特性[J]．果树学报，2015，32(1)：108-114．

LI Fei-fei, LONG Chao-an. (2015). solation，identification and latent infection characteristics of citrus anthracnose pathogens [J].JournalofFruitScience, 32(1):108-114.(in Chinese)

[23]贾娜娜，翟立峰，白晴，等．腐烂病菌的GFP标记及其在梨叶片组织中的侵染和扩展观察[J]．果树学报，2015，32(6)：1 195-1 200．

JIA Na-na, ZHAI Li-feng, et al. (2015). Marking of Valsa pyri with GFP and observing the infection and extension of marked strains in pear leaf tissues [J].JournalofFruitScience, 35(6):1,195-1,200.(in Chinese)

DetectionoftheAmountofFungiintheDifferentInfectionPeriodsofJujubeBlackSpotDiseaseinAlarArea

XU Ying1，YAO Zhao-qun1，WANG Lan2，XIE Jian-ming3，ZHAO Si-feng1

(1.KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion/CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China; 2.CollegeofPlantScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China;3.HongshanFarm, 13thDivision,XPCC,AlarXinjiang839202,China)

ObjectiveTo clarify different infection periods and infection locations of jujube black spot disease in the Alar area. The hyphae amount ofA.alternatain flowers and fruits of jujube was detected with RT-PCR in the hope of providing theoretical basis to predict and control the disease.MethodJujube flowers and fruits of different periods in the 3 surrounding orchards in Alar City area were collected and the conventional tissue separation method was used to isolate them, after that, these isolates were identified. And the fungi in flowers and fruits at different periods were detected with the specific primers ofA.alternataby real-time fluorescence quantitative PCR method.ResultA total of 276 isolates were obtained and these isolates were identified asA.alternataby morphological characteristic and β-tubulin, EF-1α gene sequencing analysis. The real-time fluorescence quantitative PCR detection results showed thatA.alternatawas checked and the amount ofA.alternatawas 2.11 μg/100 mg in the flower. The highest amount ofA.alternatawas checked in sarcocarp of fruit body and amount of fungi was 20.12 μg/100 mg. The amount ofA.alternatawas 9.34 μg/100 mg in the sarcocarp of fruit body carpopodium. The amount ofA.alternatawas 11.48 μg/100 mg in the pericarp of fruit body and 3.84 μg/100 mg in the carpopodium pericarp.ConclusionJujube black spot disease pathogens in flowering period can invade flowers. When the disease has appeared, there has been a large number ofA.alternatain the sarcocarp of fruit body, so chemical control of it should be advanced to the earlier flowering stage of red jujube.

jujube black spot disease；Alternariasp.；RT-PCR；jujube flowers and fruits

ZHAO Si-feng (1975-), male, native place: Bazhong Sichuan. Professor, PhD. research field: Biological control of plant pest. (E-mail) Zhsf_agr@shzu.edu.cn

S41-30

A

1001-4330(2017)10-1911-09

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.10.017

2017-07-21

国家星火计划“南疆红枣主要病虫害绿色防控技术示范与推广(2015GA891007)”；国家自然科学基金项目“链格孢菌Alternariaalternata对南疆骏枣果实的侵染机制(31660504)”

许瑛(1991-)，女，甘肃武威人，硕士研究生，研究方向为植物病理学，(E-mail)xyella@163.com

赵思峰(1975-)，男，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物病虫害防治，(E-mail)zhsf_agr@shzu.edu.cn

Supported by: China Spark Program"Demonstration and promotion of green prevention and control techniques for main diseases and insect pests of jujube in southern Xinjiang"(2015GA891007) and National Natural Science Foundation of China"Infection mechanism of Alternaria alternata to Jujube fruits in southern Xinjiang"(31660504)