杏鲍菇的培养及菌种鉴定

□ 帖卫芳 河套学院医学系 贾俊忠 巴彦淖尔市医院 张 叶 河套学院医学系

杏鲍菇的培养及菌种鉴定

□ 帖卫芳 河套学院医学系 贾俊忠 巴彦淖尔市医院 张 叶 河套学院医学系

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）是近年来开发栽培成功的集食用、药用于一体的珍稀食用菌新品种。本实验对市售杏鲍菇进行实验室培养并进行菌种鉴定。选用改良CYM真菌培养基，对其进行菌种分离及纯化培养，并提取总DNA进行18S rDNA保守序列的测定，将结果在NCBI上进行BLAST比对，确定其菌种，为进一步研究其营养成分奠定基础。

杏鲍菇；食用菌；菌种鉴定

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina）， 层 菌 纲（Hymenomycetes），无隔担子菌亚纲（Homobasidiomycetidae），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleurotus）。因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感而得名。其菇体具有杏仁香味，口感鲜嫩，营养丰富，而且还具有降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、增强机体免疫力、防止心血管疾病[1-2]等功效。通过本实验的研究，可以为从分子水平研究杏鲍菇的营养成分打下基础。

1 实验材料

1.1 材料

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），购买于农贸市场。DNA提取试剂盒购自OMEGA 的 Fungal DNA Mini Kit， 引物的合成及测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.2 培养基

改良CYM培养基[3-4]，每升培养基含麦芽糖10 g，葡萄糖15 g，酵母粉2 g，蛋白胨 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO44.6 g，维生素B10.3 g，pH自然，固体培养基含0.8%琼脂。

2 实验方法

2.1 杏鲍菇的实验室培养及纯化

2.1.1 杏鲍菇的实验室培养

选取菇体较肥厚的杏鲍菇用蒸馏水清洗，沥干水分，将高温高压灭菌的镊子剖开子实体的表面，另取灭菌镊子插入子实体中部取出部分子实体，接种于改良CYM培养基上。菌种于一般于接种两周后长出。

2.1.2 杏鲍菇的纯化

待菌丝长出后连续转接5次以上进行纯化。纯化好的菌丝置于4 ℃及28 ℃培养箱中保存备用。

2.2 杏鲍菇基因组DNA的提取

称取菌丝体2 g，液氮研磨至粉末状。之后提取过程按照DNA提取试剂盒的说明进行操作。

2.3 杏鲍菇的18S rDNA的鉴定及测序

根据真核生物18S rDNA保守序列设计引物18S rDNA（up）和18S rDNA（down）[5]。

引物的设计用DNAMAN生物学软件设计引物

18SrDNA（up）：5’-AGCGAAAC TGCGAATGGC -3’

18SrDNA（up）：5’-CATCCTTG GCAAATGCTTTC -3’

在25 mL的PCR反应体系中加入：DNA模 板 2 mL，2╳ Es Taq Master-Mix 12.5 mL，相应的引物（10 µmol/L）各1 mL，ddH2O 8.5 mL。PCR反应条件为：94 ℃预变性6 min；94 ℃变30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保温1 min。

以上PCR结果送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

3 实验结果

3.1 杏鲍菇的实验室培养

分离纯化后在实验条件下，以改良CYM为培养基，20 ℃培养约两周后长出的纯化杏鲍菇菌落。边缘有较粗糙的白色突起，如图1所示。

3.2 杏鲍菇基因组DNA的提取及18S rDNA的鉴定

3.2.1 杏鲍菇基因组DNA的提取

杏菇鲍总DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。由图2可见，DNA条带清晰，点样孔中无蛋白等残留，可以用于进一步的PCR鉴定。

表1 杏鲍菇基因组DNA 18S保守序列表

图1 在改良CYM培养基中生长的杏鲍菇菌落

图2 杏鲍菇基因组DNA电泳图M：λDNA/HindIII＋ EcoRI Marker；CK：负对照（ddH2O）；1、2：杏鲍菇基因组DNA

图3 杏鲍菇18SrDNA PCR电泳图M：λDNA/HindIII＋ EcoRI Marker；CK： 负 对 照（ddH2O）；1、2：杏鲍菇18S rDNA

3.2.2 杏鲍菇18SrDNA的鉴定

经1%琼脂糖凝胶电泳，杏鲍菇18S rDNA的PCR扩增结果如图3所示，其长度大约0900 bp。

3.3 测序结果分析

对照真核生物rDNA 18S保守序列设计引物18S rDNA（up）和18S rDNA（down），以杏鲍菇基因组DNA为模板扩增到长度1847 bp的序列，测序结果见表1。

将测序所得的杏鲍菇18S rDNA序列在NCBI上进行比对确定其为Pleurotus属的双芹侧耳Pleurotus eryngii。

4 结语

本实验对农贸市场上采买的杏鲍菇进行了实验环境条件下的培养，经过反复纯化确定其最适生长环境，并对纯化后的真菌提取了基因组DNA，通过DNAMAN软件进行引物设计，引物合成后进行了18S rDNA序列的PCR，结果显示得到的真菌保守序列为847 bp的碱基。将测序结果放在NCBI上进行BLAST比对确定其为侧耳属的杏鲍菇。以上工作为下一步在分子水平研究杏鲍菇的营养成分奠定了基础。参考文献

[1]马璐,杜双田,金凌云,等.杏鲍菇营养生理[J].西北农林科技大学学报,2010(9):129-134.

[2]张化朋,张静,刘阿娟,等.杏鲍菇营养成分及生物活性物质分析[J].营养学报,2013(3):307-309.

[3]赵润,郭成金.冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化[J].天津师范大学学报(自然科学版),2008(1):8-11.

[4]陆文梁,林忠平,林志彬.灵芝[M].北京:科学出版社,1985.

[5]Noriko Kinjo, Mu Zang.Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China[J].Mycoscience,2001(42):567-574.

河套学院科学技术研究项目自然科学青年项目（编号：HTXYZQ13010）。

帖卫芳（1984—），女，山西大同人，硕士，讲师。研究方向：生物化学与分子生物学。