健脾化痰活血方对甲状腺功能减退症大鼠肝脏脂肪变性的影响*

孙群群 高天舒 陈 巍 张凤暖

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032）

健脾化痰活血方对甲状腺功能减退症大鼠肝脏脂肪变性的影响*

孙群群1高天舒2△陈 巍1张凤暖1

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032）

目的观察健脾化痰活血方对甲状腺功能减退症模型大鼠肝脏脂肪变性的影响并探讨其机制。方法80只Wistar雄性大鼠饲养1周，随机选出8只为正常组，剩余72只予0.1%丙硫氧嘧啶（PTU）10mg/（kg·d）灌胃4周，建立甲减大鼠模型。模型成功后把72只大鼠随机分为6组（n＝12），即模型组、L-T4组、常量组、高量组、常量+L-T4组、高量+L-T4组，予相应处理。12周后，处死大鼠，RIA法检测血清总甲状腺素（TT4）水平，IRMA法测血清促甲状腺激素（TSH）水平；全自动生化分析仪检测三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）以及肝组织中TG、TC；光镜下观察肝细胞形态。结果4周末，与正常组比，其余各组血清TT4均明显下降（P＜0.01），TSH均明显升高（P＜0.01），证明甲减模型成立。12周末：与正常组比，模型组血清TT4明显下降（P＜0.01），血清TSH明显升高（P＜0.01），血清TC、LDL-C均升高（P＜0.05），TG明显升高（P＜0.01），HDL-C无明显变化（P＞0.05），血清ALT、AST均升高（P＜0.05），肝组织中TG升高（P＜0.05），TC明显升高（P＜0.01）；与模型组比，L-T4组、中药各剂量组、中药+L-T4各剂量组血清TT4均升高（P＜0.05或P＜0.01），血清TSH均降低（P＜0.05或P＜0.01），血脂（TG、TC、LDL-C）、肝酶（ALT、AST）、肝脏中TG、TC水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），高量组较L-T4组显著降低，但以高量+L-T4组降低最明显。形态学观察：模型组肝脏胞质内出现大量散在分布的橘红色脂滴，呈弥漫性脂肪变，各治疗组治疗后脂滴明显减少。结论甲减大鼠体内出现肝脏脂质沉积和肝细胞脂肪变性，健脾化痰活血方能改善大鼠甲状腺功能、纠正脂代谢异常、逆转肝脏脂肪变性，与L-T4合用具有协同增效的作用。

健脾化痰活血方 甲状腺功能减退症 肝脏脂肪变性

甲状腺功能减退症（甲减）是由于各种原因导致的低甲状腺激素血症或甲状腺激素抵抗而引起的全身性低代谢综合征[1]。血清促甲状腺激素（TSH）升高，甲状腺激素（T4）降低即可诊断为甲减。甲减起病隐匿，易造成心、脑、肾等器官的损害，对肝脏也可造成影响。肝脏为脂质代谢的中心器官，甲状腺激素对肝内脂质、血清胆固醇的调节起着重要的作用，临床上如非酒精性脂肪性肝（NAFLD）与肝脏代谢异常有关[2]，且NAFLD的患病率与T4水平呈负相关，T4水平的降低可增加NAFLD发生的风险。甲减患者中NAFLD的患病率为35.7%[3]，NAFLD患者中甲减的患病率为21.1%[4]，甲减可能为诱导NAFLD的独立危险因素[5]。甲减属于中医学“虚劳”“痰饮”等范畴。甲状腺手术或药物的响影，可致脾气虚衰，气虚日久则阳虚，阳虚为甲减之病本，而痰浊瘀血则为该病之标[6]。本文第二作者高天舒教授根据甲减的临床症状以及多年临床经验，自拟健脾化痰活血方治疗甲减，以改善甲状腺功能，调节免疫力低下。本研究以Wistar雄性大鼠为研究对象，旨在观察健脾化痰活血方对甲减大鼠肝脏脂肪变性的影响，为中药防治甲减致肝脏脂肪变性提供客观依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级Wistar雄性大鼠80只，体质量180～220 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001。

1.2 实验药物 健脾化痰活血方，由红参、当归、牡蛎、炙甘草、姜半夏等药物组成（涉及专利申请，未列出全部药物），中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院草药局，经浸泡、煎熬、过滤及浓缩后，常量组：制备成药物生药量为2.0 g/mL水煎液。高量组：制备成药物生药量为6.0 g/mL浓缩剂。丙硫氧嘧啶片（PTU，上海朝晖药业有限公司），左甲状腺素钠片（L-T4）（德国默克公司50μg/片）。

1.3 试剂与仪器4%多聚甲醛、10%水合氯醛、异丙醇、油红O染料（由辽宁中医药大学教学实验中心提供），血清TSH测定试剂盒、TT4放免试剂盒（购于北京北方生物技术研究所），OCT包埋剂 （德国Leica）。双蒸水、无菌饲料，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。灌胃器 （沈阳市实验试剂玻璃仪器厂）；YP10001型电子秤（上海越平科学仪器有限公司，中国）；低温高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；超低温（-80℃）冰箱（日本三洋）；直冷式冷藏冷冻（-20℃）箱（德国西门子）；高速匀浆机（德国ika）；冷冻切片机（德国Leica）；显微镜（德国Leica）；全自动生化分析仪（美国贝克曼）。

1.4 分组与造模80只大鼠于SPF级实验室饲养1周，饲以双蒸水与无菌饲料。随机选8只作为正常组，余72只予0.1%PTU按10mg/（kg·d）灌胃造模[7]。4周后，眶静脉取血进行模型评价，将成模的72只大鼠随机分为模型组、L-T4组、常量组、高量组、常量+L-T4组、高量+L-T4组，每组各12只。

1.5 给药方法 正常组、模型组予等量去离子水灌胃；L-T4组予左甲状腺素钠片悬混液5μg/（kg·d）灌胃；常量组予中药水煎液13.7 g/（kg·d）灌胃；高量组予中药浓缩液41.1 g/（kg·d）灌胃；常量+L-T4组先予左甲状腺素钠片悬混液灌胃，1 h后再按13.7 g/（kg·d）灌胃中药水煎剂；高量+L-T4组先予左甲状腺素钠片悬混液灌胃，1 h后再按41.1 g/（kg·d）灌胃中药浓缩液。每千克体质量大鼠每日剂量按60 kg成人用药剂量换算，容积为8.75 mL/kg。连续灌胃8周。

1.6 标本采集与检测4周末，经眶静脉取血，分离血清，-20℃冰箱保存，检测血清TSH与TT4，用于模型评价；8周后，大鼠处死前禁食不禁水12 h，称质量后麻醉，经腹主动脉取血，离心取血清备用，-20℃冰箱保存，待检各指标；迅速摘取肝脏，于干冰上取等体积肝组织小块存放EP管内，-80℃冰箱保存，用于肝脏脂质含量测定；肝脏组织于-80℃冰箱保存，用于肝脏形态观察。1）一般情况：实验期间，每周称取体质量1次，根据变化调整给药量，观察大鼠状态，饮食，大便及活动情况。2）甲功（TSH、TT4）测定：IRMA法测血清TSH，RIA法测血清TT4，按照试剂盒说明规范操作。3）血脂及肝酶的测定：血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）以及血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）用全自动生化分析仪检测。4）肝内脂质测定：取肝组织小块，按每100 g肝组织加入0.9 mL异丙醇，高速匀浆机匀浆，高速离心机分离上清液，全自动生化分析仪检测TG、TC含量。5）形态学观察：将肝组织从-80℃冰箱取出回温，于30%蔗糖溶液中沉降48 h，OCT包埋剂包埋后做冰冻切片进行油红O染色。40倍显微镜下观察脂肪变性情况。按肝细胞脂肪变性细胞数占总肝细胞数的百分比计算共分为4度[8]。F0：小于5%，为正常肝脏。F1：5%～30%，发生细胞脂肪变性。F2：31%～50%，为轻度脂肪肝。F3：51%～75%，为中度脂肪肝。F4：大于75%，为重度脂肪肝。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析进行处理。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有明显统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 正常组大鼠活动自如、反应灵敏，皮毛光亮，饮食、大便正常；模型组大鼠动作迟缓，反应迟钝，皮毛枯黄稀疏，纳差，大便溏；各药物治疗组（中药常量组、中药高量组、L-T4组、常量+LT4组、高量+L-T4组）大鼠治疗前情况同模型组，治疗后接近正常组；治疗过程中大鼠死亡情况：正常组1只，L-T4组2只，高量组2只，常量+L-T4组1只。

2.2 各组大鼠血清TT4、TSH水平比较 见表1。4周末：与正常组比，其余各组大鼠血清TT4降低、TSH升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），证明模型成功。药物治疗8周。12周末：L-T4组、中药各剂量组、中药+L-T4各剂量组TT4水平升高、TSH水平降低，与模型组比较有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且高量组改善优于L-T4组（P＜0.05），表明中药具有调节甲功的效果。

2.3 各组大鼠血脂水平比较 见表2。模型组血清TG、TC、LDL-C较空白组升高（P＜0.05或P＜0.01）；LT4组、中药各剂量组、中药+L-T4各剂量组均明显降低，与模型组差异有统计学意义（P＜0.01），L-T4与中药均能够降低血脂水平，以高量+L-T4组效果最佳；在血清TG、TC恢复上，高量组优于L-T4组与常量组；各组间血清HDL-C差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠治疗前后甲功水平比较（±s）

表1 各组大鼠治疗前后甲功水平比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与LT4组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与常量组比较，■P＜0.05，■■P＜0.01。下同。

治疗前 治疗后组 别n TSH（uIU/mL）TT4（ng/mL）n TSH（uIU/mL）TT4（ng/mL）正常组8 0.19±0.05 55.18±6.56 7 0.23±0.04 46.56±12.78模型组12 L-T4组12 1.21±0.12**26.59±5.77**1.25±0.18**27.53±5.35**12 10 1.22±0.50**23.99±0.49**0.81±0.12**＃＃31.10±0.72**＃＃■常量组12 1.23±0.10**25.55±4.86**12 0.92±0.39**＃27.42±0.98**＃高量组12 1.25±0.20**24.88±4.97**10 0.50±0.07＃＃▲■■35.01±1.18**＃＃▲■■常量+L-T4组12 1.23±0.15**24.83±4.94**11 0.45±0.27＃＃▲▲■■36.36±1.21**＃＃▲■■高量+L-T4组12 1.24±0.07**25.91±5.89**12 0.30±0.19＃＃▲▲■■40.00±0.94*＃＃▲▲■■

表2 各组大鼠治疗后TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较（mmol/L，±s）

表2 各组大鼠治疗后TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较（mmol/L，±s）

组 别n正常组7模型组12 L-T4组10 TG TTC LDL-C HDL-C 0.32±0.05 1.28±0.04 0.34±0.04 1.09±0.23 0.43±0.02**1.38±0.15*0.45±0.10*1.15±0.06 0.31±0.12＃1.24±0.03＃＃■0.33±0.07＃＃■1.08±0.08常量组12 0.34±0.03＃1.29±0.04＃0.39±0.08 1.15±0.15高量组10 0.26±0.08*＃＃▲■■1.15±0.07*＃＃▲■■0.30±0.12＃＃■■1.03±0.11常量+L-T4组11 0.25±0.05**＃＃▲▲■■1.12±0.10*＃＃▲■■0.27±0.04**＃＃▲■■0.96±0.08高量+L-T4组12 0.24±0.07**＃＃▲▲■■1.09±0.12**＃＃▲▲■■0.25±0.05**＃＃▲▲■■0.94±0.11

2.4 各组大鼠血清肝功能水平比较 见表3。模型组较正常组升高（P＜0.05）；L-T4组、中药各剂量组、中药+L-T4各剂量组较模型组均有不同程度降低 （P＜0.05或P＜0.01）；在血清ALT恢复上，高量组优于LT4组与常量组。

表3 各组大鼠治疗后血清AST、ALT水平比较（U/L，±s）

表3 各组大鼠治疗后血清AST、ALT水平比较（U/L，±s）

组 别n正常组7模型组12 L-T4组10 ALT AST 45.00±1.41 162.29±8.62 48.14±2.54*173.43±8.96*40.86±2.04**＃＃151.43±8.98*＃＃常量组12 42.57±2.44＃＃157.71±5.44＃＃高量组10 38.14±3.08**＃＃▲■■144.43±8.58**＃＃■■常量+L-T4组11 37.43±1.40**＃＃▲■■129.43±7.07**＃＃▲▲■■高量+L-T4组12 34.71±1.49**＃＃▲▲■■127.00±6.30**＃＃▲▲■■

2.5 各组大鼠肝脏匀浆（TG、TC）结果比较 见表4。模型组较正常组均升高（P＜0.05）；L-T4组、中药各剂量组、中药+L-T4各剂量组较模型组均有不同程度下降（P＜0.05或P＜0.01），高量组改善优于L-T4组与常量组，以高量+L-T4组效果最优。

2.6 各组大鼠肝细胞脂肪变性结果比较 见表5。空白组无肝细胞脂肪变，模型组大鼠肝细胞脂肪变为33.68%，属轻度脂肪肝；各治疗组内肝细胞脂肪变均减少，与模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组大鼠治疗后肝脏匀浆中TG、TC水平比较（mmol/L，±s）

表4 各组大鼠治疗后肝脏匀浆中TG、TC水平比较（mmol/L，±s）

组 别n正常组7模型组12 L-T4组10 TG TC 0.60±0.07 0.34±0.03 0.69±0.05*0.48±0.02**0.50±0.03*＃＃0.40±0.05*＃常量组12 0.54±0.05＃＃0.42±0.02**＃高量组10 0.37±0.07**＃＃▲▲■■0.36±0.01＃＃■常量+L-T4组11 0.33±0.03**＃＃▲▲■■0.28±0.07*＃＃▲▲■■高量+L-T4组12 0.23±0.04**＃＃▲▲■■0.25±0.03**＃＃▲▲■■

表5 各组大鼠肝细胞脂肪变性结果比较（±s）

表5 各组大鼠肝细胞脂肪变性结果比较（±s）

组 别n正常组6模型组6 L-T4组6脂肪变性（%）0±0 33.68±4.28**24.75±4.49**常量组6 27.72±4.41**＃＃高量组6 20.21±2.50**＃＃▲■■常量+L-T4组6 14.40±2.33**＃＃▲▲■■高量+L-T4组6 11.97±2.84**＃＃▲▲■■

2.7 各组大鼠肝脏组织油红O染色结果比较 见图1。空白组肝脏细胞边缘清晰、胞浆丰富、胞核完整，胞质无橘红的脂滴；与正常组比较，模型组肝细胞胞质内发现大量散在分布的橘红色脂滴，呈弥漫性脂肪变；治疗后，各治疗组脂滴数量均减少，以高量+L-T4组减少最为明显。

图1 各组大鼠肝脏组织油红O染色结果（40倍）

3 讨 论

肝脏是甲状腺激素（TH）作用的靶器官，TH水平低下可引起TC、LDL-C水平的升高及TG水平的升高，因为血清TC、LDL-C水平增高与肝细胞表面的LDL受体表达和LDL颗粒的氧化有关[9]。肝脏也是脂质代谢的中心器官，胆固醇转化和分解的任一环节出现异常均可能导致TG、TC排出受阻[10]，高TC血症、高TG血症则是非酒精性脂肪性肝（NAFLD）发病的重要因素。NAFLD已成为一个重要的公共健康问题，如不控制将会演变成非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌，其与肥胖、高脂血症、糖尿病、心血管疾病等密切相关，但甲减与NAFLD之间的机制尚不清楚。

本文第二作者高天舒教授认为脾气虚弱多为甲减初期表现[11]，治以健脾益气，并用补中益气汤治疗甲减，我们以往实验研究证明：补中益气汤可以上调下降T4的水平，且疗效显著[12-14]。脾虚为甲减之病本，脾虚则痰浊内生，气虚则瘀血阻滞，痰瘀互结日久则闭阻肝经脉络，形成脂肪肝。因此，本文第二作者高天舒教授在补中益气汤的基础上，自拟健脾化痰活血方治疗本病，方中红参、炙黄芪、当归健脾益气活血；浙贝母、鳖甲化痰散结，诸药共奏健脾化痰活血之功效。本实验通过制备甲减大鼠模型，观察健脾化痰活血方对甲减致脂肪变性的疗效。

本实验观察到大鼠机体内血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST及肝内（TG、TC）水平均升高，光镜下可见大量散在分布的橘红色脂滴，提示肝脏脂质沉积和肝细胞脂肪变性，与文献报道[15]一致。甲状腺激素通过刺激肝脏合成、血清摄取和肝内胆汁酸转化来调节血清胆固醇水平[3]，使血脂水平降低，此结果与赵家军[16]的结论相符。本研究中，中药效果与L-T4相当，但中药高量组优于L-T4，以高量+L-T4组效果最佳。由此可见，健脾化痰活血方可以调节甲状腺功能，改善脂质沉积与肝细胞脂肪变性，与L-T4联合使用有协同增效的作用。健脾化痰活血方可能成为治疗甲减合并脂肪肝的有效方剂，其疗效机制仍需进一步的实验研究。

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Effect of Jianpi Huatan Huoxue Decoction on Liver Fatty Degeneration in Rats with Hypothyroidism

SUN Qunqun，GAO Tianshun，CHENWei，et al.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110847，China.

Objective：To observe the effect of Jianpi Huatan Huoxue Decoction on liver fatty degeneration in rats with hypothyroidism.Methods80 Wistar male rats were fed for one week，and 8 rats were random ly selected for the normal group.The remaining 72 rats were given 0.1% propylthiouracil（PTU）10mg/（kg·d），for 4 weeks，to establish the model of hypothyroidism rats.After the model was successful，72 rats were randomly divided into six groups（n＝12），namely，the model group，L-T4 group，the constant group，high volume group，constant+L-T4 group，high volume+L-T4 group，and the factors of corresponding treatment were given.After 12 weeks，the level of serum TT4 was detected with RIA；the level of serum TSH was detected with IRMA；automatic biochemical analyzer was used to detect Triglyceride（TG），total cholesterol（TC），low density lipoprotein（LDL-C），high density lipoprotein（HDL-C），and total cholesterol（TC）and triglyceride（TG）in liver.Hepatocyte morphology was observed under light microscope.ResultsAt the 4 weekend，compared with the normal group，the serum TT4 levels of all the other groups decreased significantly（P＜0.01），and serum TSH was significantly increased（P＜0.01），indicating that the hypothyroidism model was established.At the 12 weekend，compared with the normal group，theserum TT4 of the model group decreased obviously（P＜0.01）；serum TSH was significantly increased（P＜0.01）；serum TC and LDL-C were increased（P＜0.05）；TG was significantly increased（P＜0.01）；serum HDL-C had no significant change（P＞0.01）；serum ALT and AST were increased（P＜0.05）；TG in liver tissue increased（P＜0.05）；TC in liver tissue was significantly increased（P＜0.01）.Compared with the model group，serum TT4 in LT4 group，the traditional Chinese medicine dose groups，traditional Chinese medicine+L-T4 dose group were increased（P＜0.05 or P＜0.01），and the levels of serum TSH were lower（P＜0.05 or P＜0.01）；the levels of lipid（TG，TC，LDL-C），liver enzymes（ALT，AST），TG and TC in liver were lower（P＜0.05 or P＜0.01）.The high volume group was significantly lower than L-T4 group，but the most significant reduction was in high volume+L-T4 group.Morphological observation：in the model group，large amounts of scattered orange fat droplets appeared in the cytoplasm of the liver，which showed diffuse fatty degeneration，and after treatment，lipid droplets in all groups were significantly decreased.ConclusionHepatic lipidosis and hepatocytes steatosis occurred in rats with hypothyroidism.Jianpi Huatan Fang can improve thyroid function，correct lipid metabolism abnormalities，and reversal of liver steatosis，and has a synergistic effect combined with L-T4.

Jianpi Huatan Huoxue Decoction；Hypothyroidism；Fatty degeneration of liver

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1707-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.005

辽宁省科学技术计划项目产业基地发展建设计划（2014226035）；辽宁中医药大学杏林优才计划（辽中医校发[2012]211号）；辽宁中医药大学中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室开放资金资助（ZYZX1511）

△通信作者（电子邮箱：gaotianshu67@163.com）

2017-05-10）