Wnt5A基因过表达对黑素细胞骨架蛋白的影响

粟倩雅 林彤 周启艳 彭霖

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所激光科

Wnt5A基因过表达对黑素细胞骨架蛋白的影响

粟倩雅 林彤 周启艳 彭霖

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所激光科

目的探讨携带Wnt5A全基因序列的质粒转染原代黑素细胞后，Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白的影响。方法培养原代人表皮黑素细胞，并分为3组：①空白对照组：除细胞外不加任何试剂；②阴性对照组：加入空白的去内毒素pcDNA3.1（+）质粒、Opti⁃MEM培养基及Lipo3000；③Wnt5A质粒组：加入Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒、Opti⁃MEM培养基及Lipo3000。Wnt5A质粒转染黑素细胞，采用qPCR法检测各组Wnt5A、Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）、丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）和β微管蛋白基因表达，Western印迹法测定Wnt5A、酪氨酸激酶受体2（ROR2）、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白表达，并通过细胞免疫荧光试验观察细胞骨架蛋白表达情况。结果qPCR法显示，Wnt5A质粒组、阴性对照组和空白对照组Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量3组间差异均有统计学意义（F=1 374.179、112.576、66.458，均P＜0.01），但β微管蛋白mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。Wnt5A质粒组Wnt5A、Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量均显著高于空白对照组及阴性对照组（P＜0.05）。Western印迹法显示，Wnt5A质粒组Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Wnt5A质粒组Rac1、ROR2、F肌动蛋白表达均明显低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），但β微管蛋白表达在3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。细胞免疫荧光实验显示，Wnt5A质粒组绿色（β微管蛋白）、红色（F肌动蛋白）荧光强度与两个对照组相比均无明显差别，但黑素细胞体积明显增大，树突数目明显增多，细胞骨架显著改变，表现为F肌动蛋白强弱不一，纹理模糊，张力丝断裂，局部呈团块状。结论黑素细胞Wnt5A基因表达升高可调控细胞骨架相关基因及蛋白表达，使黑素细胞体积增大、树突增多、骨架改变，可能有利于黑素小体的输送传递，参与色素沉着性疾病的发病。

黑素细胞；Wnt信号通路；细胞骨架；肌动蛋白类；微管蛋白；rac1 GTP结合蛋白质；Wnt5A蛋白质

在黑素瘤的发展过程中非经典通路Wnt5A表达有所增加，且Wnt5A表达增加与黑素瘤转移有很大关系［1］。在黄褐斑皮损中，Wnt5A、Wnt抑制因子1（WIF1）、分泌型卷曲相关蛋白 2（SFRP2）等多个Wnt通路相关蛋白表达也异常增高，其中Wnt5A在皮损黑素细胞中表达上调，提示它在黄褐斑黑素细胞生物学改变和黑素生成过程中起作用［2］。在黄褐斑组织学上，黑素细胞功能亢进，体积增大，突触延长，部分黑素细胞的树突甚至伸入真皮浅层，而黑素细胞数量并无明显增加［3］。我们研究Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白和黑素转运的作用。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

Medium254黑素细胞培养基、HMGS添加剂、分离酶（Protease type IX）、Triton⁃X100（美国Sigma公司），Opti⁃MEM培养基、完全1640培养基（美国Gibco公司），第一链cDNA合成试剂盒、脂质体3000（Lipo 3000）（美国Thermo Fisher Scientific公司），胰蛋白酶（美国Amresco公司），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），SYBR Green Master Mix（High ROX premixed）（美国 Vazyme 公司），Wnt5A/Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）/丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）/酪氨酸激酶受体2（ROR2）小鼠单克隆抗体（英国Abcam公司），β微管蛋白小鼠单克隆抗体（武汉谷歌生物科技公司），罗丹明标记的鬼比环肽（美国Cytoskeleton公司），鼠抗人β微管蛋白一抗抗体（美国Affinity Biosciences公司），FITC标记的山羊抗鼠IgG二抗抗体（上海翊圣生物科技有限公司），DAPI（美国Southern Biotech公司），人GAPDH内参引物、Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

二、人原代黑素细胞的分离与培养

取男童包皮环切术后多余皮肤，用分散酶作用10～14 h，分离表皮与真皮，加入0.25%胰酶，0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）室温下消化，1640培养基终止消化，弃上清液，用完全黑素培养基混悬。24 h后首次换液，去除未贴壁的细胞，15～20 d后培养细胞达到70%～80%融合时传代纯化培养。取第2～5代黑素细胞用于实验。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准，术前患者家属或监护人均签署知情同意书。

三、Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒的构建

Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司构建，质粒的酶切图谱见图1。Wnt5A基因序列参见NCBI链接地址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001256105.1。

图1 Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒的酶切图谱

四、qPCR检测Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后各基因表达

将黑素细胞接种到6孔板上，待细胞融合70%～90%时，各孔加入2 ml M254黑素细胞培养基。实验设3组：①空白对照组：除细胞外不加任何试剂；②阴性对照组：加入空白的去内毒素pcDNA3.1（+）质粒、Opti⁃MEM及Lipo3000；③Wnt5A质粒组：加入Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（+）质粒、Opti⁃MEM及Lipo3000。阴性对照组及Wnt5A质粒组质粒浓度均为0.642 g/L（实际每孔加入质粒DNA为1 μg）。转染试剂准备如下：用121.25 μl Opti⁃MEM培养基稀释 3.75 μl Lipo3000 试剂，充分混匀；用 121.44 μl Opti⁃MEM培养基稀释1.56 μl质粒DNA，然后添加2 μl P3000试剂，充分混匀。在已稀释的Lipo3000试剂中加入稀释的质粒DNA，室温孵育10～15 min。最后将DNA-脂质体复合物加入细胞孔中，轻轻摇晃培养皿以混匀。每组设3个复孔。培养48 h后提取细胞总RNA，反转录成cDNA，行qPCR实验，扩增引物序列见表1。以GAPDH为内参，扩增条件：50℃ 2 min；95℃ 预变性10 min；95℃变性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40个循环。采集荧光信号；自60℃至95.0℃缓慢升温进行熔解曲线分析。参照说明书通过相对CT法检测Wnt5A、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白基因表达。

五、Western印迹法检测Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后各蛋白表达

将黑素细胞接种到60 mm培养皿（底面积是6孔板单孔的2.2倍）上，各试剂按相应规模调整，分组、转染方法同前。培养72 h后，按细胞全蛋白提取试剂盒方法提取细胞总蛋白，蛋白样品加热变性后经电泳、转膜，与一抗、二抗孵育，ECL发光法压片显色。用软件ImageJ或Alpha Ease FC对所得条带进行灰度分析，根据目的条带与内参GAPDH条带的灰度比值计算相对灰度值，检测 Wnt5A、ROR2、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白的表达。

六、通过细胞免疫荧光实验观察Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后细胞骨架及相关蛋白表达

提前数天将细胞传代于放置有预先包被10 μg/cm2纤维连接蛋白盖玻片的12孔培养板中。待细胞融合60%～70%时，各试剂按相应规模调整后，分组、转染方法同前。培养72 h后，浸入4%多聚甲醛液中固定细胞，0.5%TritonX⁃100室温下裂解细胞后，用封闭羊血清覆盖细胞。依次滴加100 nmol/L罗丹明标记的鬼笔环肽、鼠抗人β微管蛋白一抗溶液（1∶400）、FITC标记的山羊抗鼠IgG二抗溶液（1∶200），各在37℃避光孵育30 min。用DAPI封片，于激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架及F肌动蛋白、β微管蛋白表达。

七、统计学方法

用统计学软件SPSS19.0进行统计学分析，采用单因素方差分析及SNK检验分析各组间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、qPCR检测Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后各基因的表达

Wnt5A质粒转染黑素细胞后，Wnt5A质粒组Wnt5A mRNA表达量及其下游基因Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量均显著高于空白对照组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但β微管蛋白基因表达在3组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

二、Western印迹法检测Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后各蛋白表达量

Wnt5A质粒转染黑素细胞后，Wnt5A质粒组Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Wnt5A质粒组Rac1、ROR2、F肌动蛋白表达均明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。β微管蛋白表达在3组间差异无统计学意义。见表3，图2。

表1 qPCR扩增引物序列

表2 qPCR检测各组黑素细胞Wnt5A基因及其下游基因的相对表达量（±s）

表2 qPCR检测各组黑素细胞Wnt5A基因及其下游基因的相对表达量（±s）

注：n=3。Rac1：Ras相关C3肉毒素底物1

组别Wnt5A质粒组阴性对照组空白对照组F值P值Wnt5A 812.694±37.922 1.028±0.238 1.032±0.293 1 374.179＜0.001 Rac1 4.035±0.022 1.977±0.244 1.037±0.357 112.576＜0.001丝状肌动蛋白2601.842±344.025 507.306±372.947 1.267±1.098 66.458 0.002 β微管蛋白0.870±0.218 0.660±0.108 1.013±0.203 2.829 0.208

表3 各组黑素细胞Wnt5A、ROR2、F⁃actin、β微管蛋白及Rac1蛋白条带相对灰度值（±s）

表3 各组黑素细胞Wnt5A、ROR2、F⁃actin、β微管蛋白及Rac1蛋白条带相对灰度值（±s）

注：n=3。ROR2：酪氨酸激酶受体2；Rac1：Ras相关C3肉毒素底物1

组别Wnt5A质粒组阴性对照组空白对照组F值P值Wnt5A 0.690±0.003 0.153±0.003 0.152±0.003 3 940.029＜0.001 β微管蛋白0.688±0.014 0.687±0.010 0.688±0.010 0.030 0.971丝状肌动蛋白0.423±0.009 0.822±0.011 0.823±0.010 1 918.495＜0.001 Rac1 0.706±0.015 0.883±0.012 0.882±0.113 233.699＜0.001 ROR2 0.707±0.015 0.936±0.119 0.935±0.119 1 287.949＜0.001

三、细胞免疫荧光实验观察Wnt5A质粒转染人原代黑素细胞后细胞骨架相关蛋白的表达

Wnt5A质粒组绿色（β微管蛋白）、红色（F肌动蛋白）荧光强度与两个对照组相比均无明显差别，但细胞体积明显增大，树突数目明显增多。仔细观察红色荧光图，与两个对照组相比，Wnt5A质粒组细胞骨架有明显改变，表现为F肌动蛋白纹理模糊，张力丝断裂、强弱不一，局部呈团块状。见图3。

讨 论

图2 Western印迹法检测Wnt5A质粒转染黑素细胞后各组Wnt5A、ROR2、Rac1、丝状肌动蛋白、β微管蛋白及Rac1蛋白电泳图 ROR2：酪氨酸激酶受体2；Rac1：Ras相关C3肉毒素底物1

Wnt经典通路主要由Wnt3A与β联蛋白介导，影响细胞增殖、发育和组织代谢相关靶基因表达及肿瘤的发生［4］；非经典通路通过Wnt5A、Wnt11等转导信号，调控细胞骨架形成、细胞的极性、细胞间黏附和迁移［5］。Wnt5A可以通过非经典途径调控RhoGTP酶，启动下游信号转导，影响树突形成相关蛋白。树突形成相关蛋白，包括如Ras相关的 Rac1（C3肉毒素底物 1）和Cdc4（细胞周期分裂蛋白4）。树突相关蛋白水平受RhoGTP酶调控［6］。RhoGTP酶（又称小G蛋白）是重要的细胞内信号分子，属于Ras超家族，有20多种家庭成员，其中较重要的是 RhoA、Rac1 和Cdc42［7］。RhoGTP 酶对传递整合素介导的反应非常必要，它可以紧密调节肌动蛋白细胞骨架的动力，在细胞的黏附、传递和迁移的过程中提供关键性的信号转导［8⁃9］。

在进行Wnt5A质粒转染原代人黑素细胞的实验过程中，我们起初按照Lipofectamine3000试剂推荐的转染规模（2.5 μg）进行转染，转染后发现Wnt5A质粒组及阴性对照组转染后6 h基本无细胞死亡，24、48、72 h后分别出现明显的细胞死亡，随转染时间增加，细胞死亡数目增多，至72 h提取蛋白时死亡细胞达60%～70%。实验过程中我们尝试6 h换液、24 h换液，Wnt5A质粒组及阴性对照组细胞死亡数目未见明显减少，而空白组细胞数量和形态无明显改变，考虑导致细胞死亡的原因可能是去内毒素质粒毒性较大，同时体外培养的原代人黑素细胞生存力较差，因此，我们改进了实验条件，将质粒的质量减小到1.0 μg，以保证转染后的细胞状态，使目标蛋白能够过表达。质粒设计过程中，本可以在质粒上加荧光标记，转染后可采用荧光显微镜观察，流式细胞仪测定转染效率，但考虑到质粒本身的荧光颜色可能干扰后期实验中目标蛋白的观察，因此，没有在质粒上加入荧光标记。

图3 Wnt5A质粒转染原代黑素细胞后免疫荧光染色（激光共聚焦显微镜×60） 绿色荧光标记β微管蛋白；红色荧光标记丝状肌动蛋白；蓝色荧光标记细胞核。Wnt5A质粒组细胞骨架有明显改变，表现为丝状肌动蛋白纹理模糊，张力丝断裂，强弱不一、局部呈团块状

本研究结果显示，Wnt5A过表达后，Rac1和F肌动蛋白基因均出现表达升高，但Rac1、F肌动蛋白和ROR2蛋白表达降低，β微管蛋白表达没有明显变化。我们推测Wnt5A可能通过Ca2+途径或平面细胞极性（PCP）途径，激活下游RhoGTP酶Rac1，使Rac1基因表达增加。Rac1基因参与下游通路的信号转导，激活F肌动蛋白基因，因此被消耗，使得Rac1蛋白表达减少。细胞骨架由微丝、中间丝和微管及相关的骨架蛋白组成［10］，其中微丝主要由3类蛋白质组成：肌动蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白结合蛋白。肌动蛋白有球状单体（G肌动蛋白）和丝状聚合体（即F肌动蛋白）两种形式，F肌动蛋白为双螺旋状微丝，G肌动蛋白不断地加入或脱落，使F肌动蛋白保持着聚合和解聚的动态平衡，维持细胞骨架的形态和功能［11］。F肌动蛋白减少可能是由于解聚增加，细胞内骨架蛋白发生重排；另一种可能是F肌动蛋白翻译成蛋白较转录为mRNA晚，因此F肌动蛋白未在培养72 h时出现蛋白明显升高，可能是细胞培养时间过短。β微管蛋白的mRNA和蛋白表达量均无明显改变，但免疫荧光染色显示荧光强度减弱，提示β微管蛋白在量上没有改变，而是细胞的微管系统重新排列，促进树突向外生长［12］，与F肌动蛋白共同使细胞胞体变大、树突变长。

细胞免疫荧光实验中我们发现，Wnt5A过表达的黑素细胞体积增大，树突增多，骨架重排。黑素细胞位于表皮基底层，必须通过增加树突的数量和长度才能更有效地实现向角质形成细胞转运黑素。黑素细胞树突的重要功能就是为黑素小体向角质形成细胞的输送和转运提供一个管状结构［13］。我们推测，Wnt5A表达增加后，通过活化Rac1（表现为F肌动蛋白解聚增加，纹理模糊、不连续，局部呈团块状）影响细胞树突，诱导黑素细胞内骨架蛋白的重排，使胞体增大和树突增多等。我们推测，胞体增大、树突增多、骨架重排这一系列变化可共同促进黑素细胞向角质形成细胞转运黑素小体，促进色素沉着。

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Effects of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteinsof melanocytes

Su Qianya,Lin Tong,Zhou Qiyan,Peng Lin
Laser Department,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteins of melanocytes after the plasmid containing the Wnt5A gene is transfected into primary melanocytes.MethodsIn vitrocultured primary human melanocytes were divided into three groups:blank control group receiving no treatment,negative control group transfected with endotoxin⁃free pcDNA3.1（+）empty vector by Lipo3000 in Opti⁃MEM medium,Wnt5A plasmid group transfected with endotoxin⁃free pcDNA3.1（+）vector containing the Wnt5A gene by Lipo3000 in Opti⁃MEM medium.After the trans⁃fection,quantitative PCR（qPCR）was performed to measure the mRNA expression of Wnt5A,ras⁃related C3 botulinum toxin substrate 1（Rac1）,filamentous actin（F⁃actin）and β⁃tubulin,Western blot analysis to determine the protein expression of Wnt5A,receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2（ROR2）,Rac1,F⁃actin and β⁃tubulin,and an immunofluorescence assay（IFA）to observe the expression of cytoskeletal proteins.ResultsqPCR showed significant differences in the mRNA expression of the Wnt5A gene and its downstream genes Rac1 and F⁃actin among the Wnt5A plasmid group,negative control group and blank control group（F=1 374.179,112.576,66.458,respectively,allP＜ 0.01）,but there was no significant difference in the mRNA expression of β⁃tubulin among the three groups（P＞ 0.05）.Additionally,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher mRNA expression of Wnt5A,Rac1 and F⁃actin compared with the blank control group and negative control group（allP＜ 0.05）.As Western blot analysis revealed,compared with the blank control group and negative control group,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher Wnt5A protein expression（bothP＜ 0.05）,but significantly lower protein expression of Rac1,ROR2 and F⁃actin（allP＜ 0.05）.However,no significant difference in β⁃tubulin protein expression was observed among the three groups（P＞ 0.05）.IFA showed no obvious difference in the fluorescence intensity of β⁃tubulin or F⁃actin between the Wnt5A group and the two control groups,but melanocytes showed larger size and increased number of dendrites,and the cytoskeleton changed dramatically with varying fluorescence intensity of F⁃actin,fuzzy texture,fractured or locally clustered tonofilaments in the Wnt5A group.ConclusionThe overexpression of the Wnt5A gene in melanocytes can regulate the mRNA and protein expression of cytoskeletal proteins,make melanocytes larger and more dendritic,and cause changes in the cytoskeleton,which may facilitate the transportation of melanosomes,and participate in the occurrence of hyperpigmented diseases.

Melanocytes;Wnt signaling pathway;Cytoskeleton;Actins;Tubulin;rac1 GTP⁃binding protein;Wnt5A protein

林彤，Email：ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.08.009

江苏省自然科学基金（BK2012507）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012507）

2016⁃08⁃01）

（本文编辑：周良佳 颜艳）