半互穿网络淀粉基止血海绵的制备及性能研究*

郈秀菊，朱爱臣，王军，孙淑娜，王晓晨，王传栋△

（1.山东省药学科学院，山东省医用高分子材料重点实验室，济南 250101；2.山东省中医院，济南 250011）

1 引 言

在外科手术和处理体表外伤时，血液的大量流失可能会直接危及到生命，同时血液是天然的微生物培养基，创面出血或渗血都会增加感染的几率［1-2］。因此，良好的止血技术和使用快速有效的止血材料成为外科手术成功的关键。

近年来，天然高分子多糖因具有良好的生物相容性和可吸收性及凝血作用，被广泛应用于创面止血材料［3-6］。选择植物来源的羧甲基淀粉钠为主原料，能避免动物源性材料杂蛋白引起的不良反应［7-8］；通过采用绿色高效的低温等离子体技术［9-11］，活性引发两亲性聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段聚合物接枝淀粉，与线性植物多糖羟乙基纤维素通过氢键作用［12-13］进行穿插后，经冷冻诱导相分离法制备半互穿网络淀粉基止血海绵。制备过程中有效避免使用环氧氯丙烷和醛类等毒性交联剂［14-15］，具有良好的生物相容性及生物降解性。经过动物体内止血实验和动物体内降解实验等生物学性能测试，结果表明该敷料能快速、安全、有效地应用于外科手术止血。

2 材料与方法

2.1 原料试剂

羧甲基淀粉钠（CMS），医用级，华唯纤维素有限公司；泊洛沙姆188（P188），德国BASF公司；羟乙基纤维素（HEC），医用级，粘度 6 000 MPa·s，郑州鼎驰科技有限公司；吐温60（T60），国药集团化学试剂有限公司；丙三醇、氢氧化钠，均为分析纯，天津市富宇化学试剂厂；无水乙醇，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；明胶海绵，南昌市祥恩堂医疗器械有限公司。

2.2 仪器设备

真空干燥箱，ZKXF型，上海树立仪器仪表有限公司；冷冻干燥机，FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司；等离子处理机，PLS-CX01，中山市普雷斯等离子科技有限公司；红外光谱仪，VERTEX70型，德国 Bruker公司；核磁共振波谱仪，AVAHCE III HD型，德国Bruker公司；扫描电子显微镜，SUPRA 55型，德国蔡司Zeiss。

2.3 半互穿网络淀粉基止血敷料的制备

按比例称取CMS和蒸馏水经磁力搅拌，配成一定质量分数的溶液，模具内流延后，真空干燥得到CMS膜，进行等离子体处理。等离子体处理的条件为：选择氩（Ar）气氛，控制 Ar流量为500 L/min，CMS膜和电极之间的距离为7 mm，处理功率60 W，放电频率10 kHz。经Ar等离子体处理15 min后的CMS膜在空气中暴露15 min，投入盛有一定质量分数的P188水溶液中。在4℃冰水浴中，通氮排氧条件下进行接枝聚合反应，接枝后的CMS膜称为CMS-P188膜。用蒸馏水冲洗CMS-P188膜除去未反应的P188，然后室温下真空干燥，最后粉碎成粒径为80～100目的CMS-P188粉末。

称取CMS-P188粉末8.0 g，置入250 mL烧杯，加去离子水72 mL，磁力搅拌20 min，使其充分溶解，为A液。称取HEC粉末1.6 g，置入50 mL烧杯，加去离子水18.4 mL，磁力搅拌30 min，使其充分溶解，为B液。

采用超声辅助制备氢键作用半互穿网络聚合物。将上述A、B两种溶液分别置入装有回流装置的250 mL的三口瓶中，再加无水乙醇50 mL。通氮气抽真空后，置于37℃的空气振荡浴中，100 r/min的转速振荡14 h，然后用探头超声仪100 W功率下超声1 h。为防止液体在超声中变热采用间歇脉冲工作方式，脉冲时间为3 s，间歇时间为5 s，整个超声操作在室温中进行。用0.4 mol/L氢氧化钠溶液调节体系的pH值为4.5～7.0。用无水乙醇和去离子水交互洗涤产品3次，旋蒸除去溶剂后真空干燥，得到终产物半互穿网络聚合物CMS-P188-HEC粉末 9.2 g。

取CMS-P188-HEC粉末8.0 g，丙三醇3 g，T60 1 g和蒸馏水88 g，置入烧杯中，混合搅拌0.5～1 h。高速发泡后，低温冷冻干燥，制得半互穿网络淀粉基止血海绵（semi-interpenetrating networks starch hemostatic dressing，SIN-SHD）。

2.4 红外光谱仪测试

将羧甲基淀粉钠接枝泊洛沙姆P188前后的样品干燥后，与KBr混合后压片制样，用VERTEX70型红外光谱仪进行扫描，扫描范围为400～4 000 cm-1，绘出红外光谱图。

2.5 核磁共振波谱仪测试

将羧甲基淀粉钠接枝泊洛沙姆P188前后的样品在Bruker DRX-400NMR波谱仪上进行13CNMR测试分析，溶剂是D2O（氘代水）。

2.6 吸水率测试

按照标准 YY/T 0471.1-2004［16］进行测试，称取SIN-SHD 0.8 g，置于洁净干燥的培养皿中，称重m1，加入适量去离子水，待敷料吸水饱和后，倒出多余水分，称重m2，根据公式（1）计算吸水率（A）：

2.7 膨胀体积测试

培养皿中加人预热至（37±1）℃的去离子水［16］，将 SIN-SHD裁成5 cm×1.5 cm×0.5 cm的块，放入水中至吸收完全，呈饱和状态，用镊子夹持样品一角或一端，悬垂30 s后，平铺于干燥的培养皿中，以游标卡尺测量测试样品的尺寸（长×宽×高），测试三次取平均值，计算出膨胀体积V。体积膨胀率E按公式（2）计算：

2.8 扫描电镜测试

取CMS-P188-HEC，混合其他辅料，高速发泡后，低温冷冻干燥制备SIN-SHD多孔结构的海绵状聚合物，原料CMS和HEC采用相应的处理过程制备的海绵表面真空镀金后，进行扫描电镜测试，观察两者的表面形貌。

2.9 兔肝肾止血实验

选取20只2 500～3 000 g健康新西兰兔，由山东省药学科学院生物评价中心提供，雌雄各半，随机分为2组，每组10只，分别是SIN-SHD组和明胶海绵组。麻醉后开腹，暴露肝脏和肾脏，分别在左肝外叶划开2 cm×0.5 cm的切口，在右肾表面划开1 cm×0.5 cm的切口，迅速覆盖出血部位，轻压30 s，并同时开始计时，记录止血时间，并用滤纸吸取流出的血量，称量滤纸吸血前后的质量，计算出血量，并观察敷料与创面的粘合情况。

2.10 大鼠体内降解实验

按标准 GB/T 16886.6-1997［17］的要求，选取 6只SD大鼠，由山东省药学科学院生物评价中心提供，雌雄各半，分成3组，分别植入1周，2周，4周。将本研究制备的SIN-SHD植入大鼠左右臀肌，分别同时沿肌纤维长轴平行直接包埋。用低倍放大镜检查切下的植入部位组织，记录观察到的组织反应的特性和程度。并且分别切取臀肌植入部位组织标本，包括植入物及其周围足够多的未受到影响的组织。组织标本经中性甲醛溶液固定，常规脱水、包埋、石蜡切片、HE和刚果红染色后，光学显微镜下进行组织学评价。

3 结果与讨论

3.1 配方筛选

分别配制质量浓度为3%、5%、8%、13%和15%的CMS水溶液，流延真空干燥成膜，经低温等离子体处理，在冰水浴中接枝PEO-PPO-PEO聚合物（P188），P188水溶液的质量浓度分别为1%、3%和4%，之后流延真空干燥制成CMS-P188膜。测试不同溶液浓度制备的CMS-P188膜的吸水率和膨胀率，结果见表1，最优配方为：8%的CMS溶液接枝3%的P188。

3.2 成型工艺研究

在制备SIN-SHD的冷冻干燥工艺中，冷冻诱导相分离温度分别选择-18、-35、-55和-60℃，冷冻诱导相分离时间分别为5、10、15和20 h，观察SIN-SHD的状态和吸水率，结果见表2，最优工艺条件为：温度为-55℃、时间为15 h。

表1 CMS-P188膜的吸水率和膨胀率Table 1 The water absorption and expansion rate of the CMS-P188 film

表2 冷冻诱导相分离条件对SIN-SHD性能的影响Table 2 The effects of the freeze drying conditions on the SIN-SHD

3.3 红外光谱分析

分别将羧甲基淀粉和羧甲基淀粉接枝P188后的样品作红外光谱分析，结果见图1。

由图1可知，图谱a中，1618 cm-1处的峰为羧甲基淀粉中C＝O双键的伸缩振动峰，而图谱b中，1618 cm-1处的峰的强度明显减弱，由此可知，羧甲基淀粉中的C＝O双键已接枝P188，使羧甲基淀粉中C＝O双键的伸缩振动减弱，可初步证明羧甲基淀粉已接枝了P188。

3.4 核磁谱图分析

将羧甲基淀粉钠接枝泊洛沙姆P188前后的样品在Bruker DRX-400 NMR波谱仪上进行13CNMR表征，溶剂是D2O（氘代水），结果见图2。羧甲基淀粉钠的羧基碳的化学位移由原来182.325 ppm向低场移动为177.86 ppm，说明羧甲基淀粉钠的羧酸接枝成羧酸酯，羧甲基淀粉钠接枝上了泊洛沙姆P188。

图1 羧甲基淀粉（a）和羧甲基淀粉接枝P188（b）的红外光谱图Fig 1 The infrared spectrogram of CMS（a）and CMS-P188（b）

图2 羧甲基淀粉（a）和羧甲基淀粉接枝P188（b）的核磁共振谱图Fig 2 The13 C-NMR spectrum of CMS（a）and CMS-P188（b）

3.5 扫描电镜测试

原料 CMS和 HEC（a）和 SIN-SHD（b）的扫描电镜照片（放大200倍）见图3。由图3可知，本研究制备的SIN-SHD形成了相互贯通的网络骨架多孔形貌，进一步为SIN-SHD止血海绵快速吸液提供了基础。

图3 原料CMS和HEC（a）和SIN-SHD（b）的扫描电镜照片Fig 3 The SEM test of CMS（a）and SIN-SHD（b）

3.6 兔肝肾止血实验

在兔肝脏和肾脏手术部位，用刀片切开后均有大量出血现象，用本研究制备的SIN-SHD和明胶海绵迅速覆盖住伤口创面，观察敷料与创面的粘合情况，并记录止血时间和出血量，测试结果见表3。由研究结果可知SIN-SHD可在创面形成一层凝胶状膜，并且SIN-SHD的止血时间短，出血量少，可快速有效的止血。由此可知本研究制备的SINSHD是一种快速有效的止血敷料。

表3 兔肝肾止血实验结果Table 3 The results of rabbit liver and kidney bleeding experiments

3.7 大鼠体内降解实验

在植入期内适当的间隔观察每只动物，均无任何异常现象。试验期结束时，采用超剂量麻醉将动物无痛处死，切取植入部位组织标本，分别通过低倍放大镜和组织病理学试验评价生物学反应。低倍放大镜观察结果为植入部位肌肉包膜全部完好。HE染色结果显示：植入部位及周围肌肉组织肌纤维均排列整齐、核清晰，未见坏死及肉芽肿形成，间质无纤维化及炎性细胞浸润。刚果红染色结果显示4周后植入部位无残存材料碎片，4周后的组织切片图见图4。

图4 组织切片图Fig 4 The figures of the tissue section

4 结论

本研究采用低温等离子体技术和冷冻干燥工艺制备了半互穿网络淀粉基止血海绵。优化实验配方为8%的CMS溶液接枝3%的P188，冷冻干燥工艺为冷冻诱导相分离温度为-55℃，冷冻诱导相分离时间为15 h，采用此工艺制备的淀粉基止血海绵具有良好的亲水吸水性、快速有效的止血效果和良好的生物降解性。