“标本配穴”电针对糖尿病肾病的改善作用及肾脏SIRT1 蛋白表达水平的影响❋

何文娟，陈 丽，舒 晴，周焕娇，王雅媛，高 炎，陈 瑞，吴 松，唐宏图，梁凤霞△

(1. 湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉 430061； 2.武汉市第九医院，武汉 430082； 3. 华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022)

【针灸研究】

“标本配穴”电针对糖尿病肾病的改善作用及肾脏SIRT1蛋白表达水平的影响❋

何文娟1,2，陈 丽1，舒 晴1，周焕娇1，王雅媛1，高 炎1，陈 瑞3，吴 松1，唐宏图1，梁凤霞1△

(1. 湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉 430061； 2.武汉市第九医院，武汉 430082； 3. 华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022)

目的：观察“标本配穴”电针干预方法对糖尿病肾病大鼠模型肾功能、超微结构的改善作用及肾脏SIRT1蛋白表达的影响。方法： Zucker fa/fa大鼠12只按随机数字表法分为模型对照组及非电针刺激组、电针治疗组，另选其同窝瘦鼠(Zucker+/?)4只作为空白对照组。非电针刺激组和电针治疗组分别治疗3周，于治疗后第21天测其4组大鼠的饮水量、进食量、体质量和空腹血糖、餐后血糖；治疗3周后大鼠处死，观察血清白蛋白、血肌酐、血尿素、血尿氮、肾脏超微结构及SIRT1蛋白表达水平。结果：与模型对照组比较，“标本配穴”电针治疗组大鼠进食量减少，体质量降低，空腹血糖、餐后血糖降低，血肌酐、血尿素、血尿氮水平降低，肾脏超微结构得到明显改善，SIRT1蛋白表达增多。结论：“标本配穴”电针能够改善糖尿病肾病肾功能和超微结构，可能与其上调肾脏SIRT1蛋白表达水平有关。

糖尿病肾病；标本配穴；电针；SIRT1；Zucker大鼠

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性微血管并发症，是终末期肾病的主要原因[1]，也是糖尿病致死致残的最主要原因之一。

近年来研究表明，沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)与糖尿病肾病的发生发展密切相关，而成为糖尿病肾病的一个新潜在治疗靶点[2-3]。SIRT1可以从增加肾脏游离脂肪酸代谢、改善肾脏线粒体功能、促进肾脏细胞恢复自噬、减少肾脏细胞凋亡、抑制炎症产生、减轻肾脏纤维化等方面延缓糖尿病肾病进程[4]。而在糖尿病肾病动物模型Zucker fa/fa大鼠中SIRT1表达下降[5]。因此，我们采用“标本配穴”电针刺激糖尿病肾病大鼠，观察“标本配穴”电针对糖尿病肾病的改善作用及肾脏SIRT1蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

选择7周龄雄性Zuckerfa/fa大鼠12只及其同窝瘦鼠4只(由北京维通利华实验技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001，大鼠(动物许可证号为SYXK(鄂)2010-0057)在华中科技大学同济医学院SPF级动物饲养间饲养，温度(23±2)℃，湿度50%～70%，12 h明暗交替。实验过程遵守《实验动物伦理与福利》相关原则和规定。

1.2 主要试剂与仪器

RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)；PMSF(碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)； PVDF膜(Millipore)；SIRT1 多克隆兔抗、β-actin多克隆兔抗(美国Santa Cruz 公司，批号sc-15404、sc-9104)；蛋白Marker (美国Fermentas 公司，批号26616)。

针灸针(环球牌0.30×13 mm一次性针灸针)； HANS LH202H 型韩氏电针仪(南京济生医疗科技医疗有限公司)；精密电子秤(SF- 400A，上海志荣电子科技公司)；快速血糖仪(强生(中国)投资有限公司)； ELX800 酶标仪(美国Biotek 公司)；DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)； EBA12R 低温离心机(德国Hettich 公司)；日立H2600型透射电镜(武汉大学医学院电镜实验室)。

1.3 分组及处理方法

将12只Zuckerfa/fa大鼠按随机数字表法分为模型对照组(B组)、非电针刺激组(C组)、电针治疗组(D组)各4只，另选无脂质等代谢紊乱、无胰岛素抵抗的同窝瘦鼠(Zucker +/?)4只为正常对照组(A组)。

C组和D组大鼠按“标本配穴”法，取“本”穴“关元”“足三里”和“标”穴“中脘”“丰隆”[6]。“关元”向耻骨联合部斜刺3 mm左右，“中脘”向剑突方向斜刺3 mm左右，“足三里”和“丰隆”直刺3 mm左右连接电针治疗仪，接线方式为同侧负极接“足三里”穴，正极接“丰隆”穴，另一组电针负极接“关元”，正极接“中脘”，其中足三里和丰隆两穴为左右交替使用。C组不通电，D组通电，频率2Hz，强度1mA,留针10 min。隔日针刺1次，共治疗3周。A组和B组大鼠不给予电针或非电针刺激，仅与C组、D组以相同方法、相同时间段内抓取固定。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 大鼠一般情况 在治疗后第21天测量各组大鼠的饮水量、进食量和体质量。

1.4.2 大鼠空腹血糖、餐后血糖 在治疗后第21天采用尾静脉采血的方式，对所有大鼠的空腹血糖及餐后血糖进行测量。测量空腹血糖之前，大鼠禁食不禁水12 h。

1.4.3 检测大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸 3周治疗结束后，各组大鼠给予腹腔10%水合氯醛注射麻醉(剂量为0.35 ml/ 100 g)，快速处死，心尖取血入抗凝管，送往我校附属医院湖北省中医院检测血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸。

1.4.4 大鼠肾脏超微结构观察 在冰上迅速取肾脏1 mm3大小的组织块,用4%冷戊二醛溶液固定,送往我校合作单位武汉大学用于透射电子显微镜观察。

1.4.5 大鼠肾脏SIRT1蛋白表达 用化学免疫印迹法检测肾组织SIRT1蛋白表达水平，取绿豆粒大小的肾脏组织在碎冰中研磨，裂解组织提取总蛋白，BCA 法进行蛋白浓度定量。制胶，各样本均上样30 μg/孔蛋白进行SDS-PAGE 电泳，并转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入β-actin和SIRT1一抗于4 ℃ 下孵育1.5 h，二抗封闭，孵育1 h洗涤。加入化学发光底液PlusA液和PlusB液，暗室中用X 线片曝光、显影、定影，置于成像仪中进行定量分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

表1显示，在治疗后第21天，各组大鼠的饮水量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较，其他3组进食量显著增多(P<0.01)，体质量显著上升(P<0.01)。与模型对照组比较，非电针刺激组的进食量显著减少(P<0.01)，体质量虽有所减轻但差异无统计学意义(P>0.05)；电针治疗组进食量显著减少(P<0.01)，体质量明显降低(P<0.05)。

2.2 各组大鼠空腹血糖、餐后血糖比较

表1显示，在治疗后第21天与空白对照组比较，其他3组的空腹血糖、餐后血糖均显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，非电针刺激组餐后血糖明显降低(P<0.05)，而空腹血糖差异无统计学意义(P>0.05)；电针治疗组大鼠空腹血糖和餐后血糖均明显下降(P<0.05)。

表1 各组大鼠饮水量、进食量、体质量、空腹血糖、餐后血糖比较

注：与空白对照组比较：△△P<0.01；与模型对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表2 各组大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿酸、血尿氮和SIRT1蛋白灰度比值比较

注：与空白对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3 各组大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸比较

表2显示，各组大鼠血清白蛋白浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较，非电针刺激组血肌酐、血尿酸浓度明显升高(P<0.05),血尿酸浓度显著升高(P<0.01)；电针治疗组血肌酐、血尿酸、血尿氮浓度虽然升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，非电针刺激组血肌酐、血尿氮浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)，血尿酸浓度明显降低(P<0.05)；电针治疗组血肌酐、血尿酸浓度明显降低(P<0.05)，血尿酸浓度显著降低(P<0.01)。

2.4 各组大鼠电镜观察结果

图1显示，空白对照组大鼠基底膜结构良好，足突排列较为整齐清晰；内皮孔清晰可见，内皮细胞核呈细长形居中，核仁明显；足细胞体积较大，形态不规则，排列于基底膜外侧。模型对照组大鼠基底膜出现显著增厚，尤其是在足细胞侧出现驼峰状增厚，上足突增宽；内皮细胞体积缩小；足细胞体积肿胀，数量减少。非电针治疗组基底膜出现较明显增厚，足突排列不整齐，部分足突出现弥漫性融合甚至消失；内皮细胞萎缩，足细胞固缩数量减少。电针治疗组基底膜结构较好，偶见增厚和上足突增宽；内皮细胞体积缩小，内皮细胞胞质内可见多泡小体，足细胞体积较大，形态排列均不规则。

图1 “标本配穴”电针对糖尿病肾病大鼠肾脏超微结构影响

2.5 各组大鼠肾组织SIRT1蛋白表达比较

表2图2显示，与空白对照组比较，其他3组SIRT1蛋白表达均显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，非电针刺激组SIRT1蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；电针治疗组SIRT1蛋白表达明显增多(P<0.05)。

图2 “标本配穴”电针对糖尿病肾病大鼠肾脏SIRT1蛋白表达的影响

3 讨论

目前针对糖尿病肾病尚无特效治疗方法，主要是通过运动、低蛋白饮食、控制血糖血压、降脂和血管紧张素等药物来治疗[7-8]。这些方法对糖尿病肾病虽有缓解作用，但治疗效果不明显，且长期服用西药对人体肝肾功能损伤较大。因此，更多的治疗糖尿病肾病的方法需要被研究揭示。现有研究已证实,针灸可以从调节糖脂代谢、降低尿蛋白排泄率、改善肾功能、增加肾脏血流灌注等方面治疗糖尿病肾病[9-12]。

Zucker fa/fa大鼠是目前公认的2型糖尿病和肥胖的遗传性大鼠模型，不仅表现为血脂等代谢紊乱，胰岛素分泌缺失(β细胞功能受损)、胰岛素利用障碍(肝脏和肌肉等组织胰岛素抵抗)和糖耐量异常等特征[5]，还有肾小球、肾小管的损伤及蛋白尿、肌酐清除率下降等,一系列证据表明Zucker fa/fa大鼠中存在糖尿病肾病[13-16]。

本实验以中医针灸“治未病”理论为指导,提出“标本配穴”法[17]，即固护正气腧穴为本、祛除邪气腧穴为标，增强机体抵抗病邪能力为本，同时利导邪气排除，注重调动机体整体潜在抗病能力为标，标本同治达到防治疾病的目的，两者配合应用腧穴配伍方法[18]。选取关元、足三里、中脘、丰隆进行针灸治疗。关元为任脉与足三阴经交会穴，针之可以益精补气，扶助人体先天之本；足三里为胃经合穴和胃腑之下合穴，针之可补益气血生化之源，固护后天之本；关元、足三里相配合，兼顾先天和后天，补益正气；中脘穴位胃之募穴，八会穴之腑会，针之可以健脾和胃，通降腑气；丰隆为胃经之络穴，具有化痰定喘、宁心安神之功；中脘、丰隆配合可调理肠胃、化痰和胃、祛除邪气。四穴配合固护先天和后天，祛邪防微，可达以治为防、防治结合之目的。

另外有研究发现，电针尤其是低频电针能够促进β内啡肽的释放，增强胰岛素分泌[19]，改善糖尿病，因此本研究采用低频电针进行干预。

本实验研究表明，“标本配穴”电针能够减少糖尿病肾病大鼠的进食量，降低其体质量，但对其饮水量无明显影响；“标本配穴”电针也能够降低糖尿病肾病大鼠的空腹血糖和餐后血糖；虽然“标本配穴”电针对糖尿病肾病大鼠的血清白蛋白无明显影响，但能显著降低其血肌酐、血尿酸、血尿氮的浓度。这些结果提示， “标本配穴”电针能够改善糖尿病肾病的肾功能，而且“标本配穴”电针对糖尿病肾病大鼠肾脏的超微病理学结构有明显改善作用，还能显著上调糖尿病肾病大鼠SIRT1蛋白的表达水平。

课题组前期的研究显示，“标本配穴”电针能够改善高脂饮食所致胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性，这与“标本配穴”电针提高骨骼肌SIRT1蛋白表达水平有关[20]。有研究发现，电针能治疗膝骨关节炎，其作用机制与电针提高膝骨关节软骨的SIRT1表达相关[21]。另有研究证实，电针能改善老年痴呆症的脑能量代谢，其作用与电针上调海马体的SIRT1表达联系密切[22]。我们由此推测，电针对全身多个器官的SIRT1都有作用，从而发挥电针整体调节的作用，这有待进一步的研究来证实。

综上所述，“标本配穴”电针具有改善大鼠糖尿病肾病的作用，可能与上调肾脏SIRT1蛋白的表达水平有关。

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TheEffectsofElectro-acupunctureonDiabeticNephropathyandTheExpressionofRenalSIRT1ProteininZuckerDiabeticFattyRats

HE Wen-juan1, CHEN Li1, SHU Qing1, ZHOU Huan-jiao1, WANG Ya-yuan1, GAO Yan1, CHEN Rui3, WU Song1, TANG Hong-tu1, LIANG Feng-xia1△

(1.HubeiProvincialCollaborativeInnovationCenterofPreventiveTreatmentbyAcupunctureandMoxibustion/HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430061,China; 2.TheNinthHospitalofWuhan,Wuhan430082,China; 3.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Objective: To observe the effect of "the Combination of Biao-Ben Acupoints" electro-acupuncture(EA) on renal function，kidney ultramicrostructure， and the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy rats model. Methods:12 male Zucker fa/fa rats, were randomly divided into model control group, none EA group,EA group and 4 in each group. 4 zucker lean (ZL) rats (fa/-),their lean normoglycemic littermates, were set for control group. none EA group and EA group was treated, after 3 weeks, all rats were sacrificed and the blood,kidney were extracted for detection. Results: After treatment, Compared with model control group, the EA group’s food-intake reduced,weight lossed, fasting and postprandial blood glucose lower, the level of CREA, UA,BUN dropped,kidney ultramicro- structure improved,the expression of renal SIRT1 protein up-regulated. Conclusion："The Combination of Biao-Ben Acupoints" EA can improve renal function，kidney ultramicro -structure，up-regulate the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy; The Combination of Biao-Ben Acupoints; Electro-acupuncture; SIRT1; Zucker fa/fa Rats

R245.9+7

B

1006-3250(2017)09-1280-04

国家自然科学基金资助项目(81473787)-针刺通过调控下丘脑SIRT1/ FoxO1 治疗胰岛素抵抗肥胖的机制研究

何文娟(1988-)，女，湖北谷城人，医学硕士，从事针灸作用机理研究。

梁凤霞(1975-)，女，教授，医学博士，博士研究生导师，从事针灸作用机理研究，Tel：18971371818，E-mail：315938821@qq.com。

2017-03-18