补肾益脑灸法通过Wnt信号通路影响围绝经期抑郁症大鼠海马神经发生❋

邓 雪，任 路△，冷 雪，张 囡，王 旭

(1. 辽宁中医药大学，沈阳 110847； 2. 中国医科大学药学院，沈阳 110122)

【针灸研究】

补肾益脑灸法通过Wnt信号通路影响围绝经期抑郁症大鼠海马神经发生❋

邓 雪1，任 路1△，冷 雪1，张 囡2，王 旭1

(1. 辽宁中医药大学，沈阳 110847； 2. 中国医科大学药学院，沈阳 110122)

目的：基于Wnt信号通路观察补肾益脑灸法对围绝经期抑郁症大鼠海马神经干细胞分化标记物表达的影响并探讨其治疗机制。方法： 60只大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、假手术组、西药组和艾灸组5组，采用去势和慢性不可预见刺激结合制备围绝经期抑郁症大鼠模型。连续治疗28 d，观察大鼠一般情况变化、动情周期、体质量及糖水消耗实验结果，运用ELISA法检测海马组织中的GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin，RT-PCR法检测海马组织中的GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA表达。结果：造模后其他组较空白组表现出抑郁行为，而治疗后抑郁行为好转，西药组、艾灸组及假手术组较模型组海马组织中GFAP、GSK-3β及GSK-3βmRNA的表达量增加，Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA表达量有所减少。结论：补肾益脑灸法可以通过调节海马Wnt通路GSK-3β、β-catenin的表达调控海马神经干细胞的定向分化，对围绝经期抑郁症起到治疗作用。

补肾益脑灸法；围绝经期抑郁症；GFAP；Tuj-1；GSK-3β；β-catenin

大量国内外临床流行病学调研发现，女性围绝经期抑郁症的发病率远远高于其他生命阶段[1-2]。“抑郁症海马神经元再生障碍”假说的提出，是近年来抑郁症病因学研究最具突破性的进展之一，该假说认为抑郁症的发生与神经可塑性失调密切相关[3]。“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，其藏与干细胞处于休眠状态相关，只有出现损伤或者刺激时才会被激活，而肾精的激活与肾中阳气的推动密切相关，围绝经期抑郁症大鼠的治疗作用体现在大鼠海马区神经干细胞定向分化的调控方面。为探讨神经干细胞定向分化与肾阳推动作用之间的联系，本实验拟建立围绝经期抑郁症大鼠模型,通过艾灸干预后观察海马神经干细胞分化标记物GFAP及Tuj-1表达，观察神经干细胞分化情况，检测海马wnt信号通路关键蛋白GSK-3β、β-catenin蛋白及基因的表达，探讨补肾益脑灸法对围绝经期抑郁症的作用机制。

1 材料

1.1 主要药品与试剂

10﹪水合氯醛(北京索莱宝股份有限公司),盐酸氯米帕明片25 mg/片(江苏恩华药业股份有限公司生产,生产批号20140104),GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin酶联免疫试剂盒(ameko购于上海岚派生物科技有限公司), 反转录试剂盒(ProtoScript© II First Strand cDNA Synthesis Kit NEB，#E6560S)，荧光定量PCR试剂盒(Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix,Agilent， #600838)。

1.2 实验动物

选用SPF级雌性SD大鼠，日龄56～62 d，体质量(200±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物合格证号SCXK(京)2012-0001)。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定[4]。

1.3 主要实验仪器

LEICA DM LS2显微镜(德国, Leica公司生产), DFC500数码成相软件(德国, Leica公司), 酶标仪(Gnth 52010), 荧光定量PCR仪(Agilent公司)，805-AⅡ型电针治疗仪(广东汕头市医用设备厂)。

2 方法

2.1 分组

所有大鼠适应性喂养21 d(辽宁中医药大学SPF级动物实验室), 按随机数字表法将60只大鼠分为空白组、模型组、假手术组、西药组、艾灸组每组各12只。

2.2 模型制备

围绝经期模型的制备[5]：除空白组和假手术组大鼠外均行双侧卵巢摘除术。假手术组麻醉固定后仅进行至拉出卵巢动作并不进行结扎切除，后续手术操作同摘除卵巢组。

抑郁症模型的制备：对采用P. Willner[6]传统慢性不可预见性刺激造模改良，除空白组外所有大鼠进行模型制备，造模21 d，刺激包括夹尾(用止血钳夹住距大鼠尾尖1 cm处1min)、冰水游泳(4 ℃，5min)、热应激 (45 ℃，5min)、禁食禁水(24 h)、束缚限制行动(1 h)、潮湿垫料并倾斜笼子(24 h)和昼夜颠倒(24 h)共7种。每天随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，2 d之中同一刺激不在相同个体上重复执行共21 d。

2.3 治疗方法

空白组、模型组及假手术组大鼠正常饲养，不接受刺激。西药组：使用盐酸氯米帕明片，将药片用研钵研碎后溶于0.9%生理盐水，按20 mg/kg·d-1用量灌胃[7]，每日1次，连续28 d。艾灸组:穴位定位参照《实验针灸学》[8],取双侧“肾俞” (位于大鼠背部, 第二腰椎下旁开5 mm之两旁肋间)，头顶“百会”(顶骨正中)，双侧“三阴交”(后肢内踝尖直上10 mm)，以上穴区备皮，在穴位上方2～3 cm处进行艾灸(特制直径约0.6 cm，长12 cm,纯艾绒艾条)，每日1次，每次15 min,连续28 d。

2.4 指标检测

实验结束时，除去实验过程中大鼠死亡情况，各组均取用10只大鼠做相应指标的检测。

2.4.1 动情周期检测[9]去势手术结束后休息3 d，在第4、5、6、7、8天逐只进行阴道涂片检查，以不出现动情期反应(未见成熟脱落细胞)确定卵巢摘除完全为造模成功。

2.4.2 一般情况观察 抑郁症模型复制过程中，观察记录大鼠一般情况包括饮食饮水、活动度、精神状态、毛色等。

2.4.3 体质量测定 分别于抑郁症模型制备开始前、造模后及治疗后测定每只大鼠体质量。

2.4.4 糖水偏嗜实验[10]实验前，在隔噪音且安静的房间内训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h 2瓶均装有1%蔗糖水，随后的24 h 1个瓶装有1%蔗糖水，1个瓶装纯净水，为避免场所偏爱，蔗糖水瓶的相关位置(左或右)在测试时进行变化。在实验前或实验中没有食物和水的剥夺，进行动物基础糖水/纯水消耗实验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶，1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水，24 h后取走2瓶并称重，计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗，糖水偏嗜(糖水偏嗜=糖水消耗/总液体消耗×100%)。

2.4.5 GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin检测 表1显示，所有动物实验结束后禁食24 h不禁水，用10%水合氯醛麻醉后打开腹腔，剥离腹主动脉，用负压取血管迅速吸取血液。剪开大鼠颅骨，将海马从脑组织中分离出来，海马组织匀浆后加入离心管中放入高速离心机以3000 r/min离心10 min，吸取上清液，保存在-80℃冰箱中备用。GFAP、Tuj-1、GSK-3β和β-catenin含量的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA法)，试剂的配制和操作按试剂盒说明书进行。大鼠大脑海马GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA运用荧光定量PCR法检测。用Trizol提取总RNA，CDNA由NEB试剂公司合成，荧光定量PCR反应条件：95 ℃， 10 min；40×(95 ℃ 20 s；59 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)。

2.5 统计学方法

表1 荧光定量PCR法检测引物序列

表2 各组大鼠体质量及糖水偏爱

注：与空白组比较：※P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05

3 结果

3.1 动情周期检测

图1 空白组阴道涂片染色(×200)

图1、2显示，空白组和假手术组阴道涂片染色结果显示，动情前期几乎全部是有核上皮细胞，动情中期全部是角化上皮细胞间或有少量上皮细胞，动情后期有白细胞、角化细胞和核上皮细胞，动情间期有大量白细胞及少量上皮细胞。2组均有周期性动情出现，而模型组等无此周期改变，证明去势模型成功。

图2 假手术组阴道涂片染色(×200)

3.2 一般情况观察

抑郁症造模结束后，除空白组外大鼠普遍食欲下降，活动度减少，嗜睡倦卧，被毛乏泽蓬松，便质大多稀溏，表情淡漠且反应迟缓。治疗后，艾灸组西药组上述一般情况明显改善，模型组、假手术组一般情况有所好转，但观察仍差于空白组、西药组和艾灸组。

3.3 体质量及糖水实验测定

表2显示，治疗前各组大鼠体质量及糖水偏嗜其他各组与空白组比较均有下降(P<0.05)，证明抑郁症造模成功。治疗后艾灸组、西药组与模型组、假手术组比较均有升高(P<0.05)，证明治疗后治疗组抑郁情况有所好转。

3.4 各组大鼠海马组织ELISA法检测GSK-3β、β-catenin、GFAP及 Tuj-1，RT- PCR法测定GSK-3βmRNA及β-catenin mRNA

表3显示， 模型组海马组织中GFAP、GSK-3β及GSK-3β mRNA 含量较空白组减少(P<0.05)，西药组、艾灸组、假手术组与模型组比较增加(P<0.05)，艾灸组、西药组与假手术组比较减少(P<0.05)。Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA比较模型组较空白组含量增多(P<0.05)，西药组、艾灸组、假手术组与模型组比较减少(P<0.05)，艾灸组、西药组与假手术组比较有所增加(P<0.05)。表明治疗结束时海马神经干细胞分化情况有所改变，治疗组GFAP含量减少，Tuj-1含量增多，wnt信号通路处于激活状态。

4 讨论

实验用大鼠预养至77 d龄以上确保大鼠处于性成熟状态[11]，以卵巢摘除与慢性不可预见性刺激法合并复制围绝经期抑郁症动物模型[12]。从实验结果观察到，造模后大鼠一般情况、体质量及糖水偏好较空白组明显减少，合并复制模型在表面效度、结构效度、预测效度上均有优势[13]。

表3 神经干细胞分化及wnt信号通路相关指标变化

注：与空白组比较：※P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05

《素问·生气通天论》曰:“阳气者，若天与日，失其所，则折寿而不彰。”阳气的性质向上而积极，抑郁症则表现出 “三低”和“六无”，以阳气不足表现在外。关于阳气亏虚与抑郁症的探讨一向受到重视[14-16]，中医基础理论有阴阳互根互用、阴中求阳、阳中求阴的论断。肾属五脏位于下焦,藏精、主骨生髓；脑属奇恒之腑位置最高,为诸阳之会,主认识,一属阴一属阳,上下升降互济,肾精肾水上滋脑髓,脑固摄升提肾气,相互作用,互生互长。肾亏则脑髓失养,神明清窍失灵,脑神不清则肾不气化,以致百病从生[17-18]。肾阳虚不能推动肾精上济脑髓，不能推动脑内神经干细胞分化，脑海空虚则出现思维迟缓、意志减退等症状。补肾益脑灸法恰是针对这种情况的治疗方法。本次实验选取督脉“百会”、足太阳膀胱经“肾俞”，足太阴脾经“三阴交”为主要治疗穴位。督脉“入属于脑”，膀胱经 “上额, 交巅, 从巅入脑络”, 本经主治神志病。“头为诸阳之会”，“百会”开窍醒神，升提一身阳气，善治郁证[19]。 “肾俞”善滋肾精，临床治疗围绝经期抑郁症累计频次居高[20]，“三阴交”为足之三阴交汇互通之穴，重在滋阴，填补肾精，临床选穴常用。选用灸补方法进行治疗， 拟探讨激发肾中阳气对肾精上济脑髓及脑内干细胞定向分化的作用及作用机制。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞特有的细胞骨架蛋白，并被认为是星形胶质细胞成熟的标志[21]。经过抗抑郁治疗，GFAP的海马表达与神经发生密切相关[22]。经治疗后，治疗组GFAP分化程度比模型组增高，这可能是电针治疗抑郁症刺激神经干细胞分化的证据之一。Tuj-1是一种被认为参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白，抑郁症领域相关研究也多用Tuj-1的表达监测神经干细胞的增殖及分化水平[23-24]。至于本次试验结果显示，Tuj-1在模型组表达最高，这有可能是机体代偿性变化的结果。

Wnt信号通路是广泛存在于真核生物中的一条高度保守的信号通路。β-catenin和GSK-3β是Wnt信号通路的关键信号分子[25]。肾中阳气对干细胞定向分化的推动作用恰与Wnt信号通路对神经干细胞的调控非常相似。有关Wnt信号通路下游分子β-catenin和GSK-3β等在神经干细胞增殖、分化与细胞命运决定等过程中的作用，文献报道存在较大差异[26-27]。实验发现，抗抑郁药物通过抑制 GSK-3β和增加β-catenin蛋白刺激神经发生对抑郁症起到治疗作用[28-29]。有体外实验发现，随着神经细胞分化的进行β-catenin表达量逐渐减少，而GSK-3β蛋白表达量逐渐增加，显示Wnt信号通路由活化状态逐步走向抑制过程[30]。有研究发现，Wnt信号通路状态与神经细胞进入定向分化有关[31]。体外实验研究发现，Wnt信号通路的状态与GFAP的表达量密切相关[32-33]。

综上分析，本研究结果表明补肾益脑灸法能诱导海马神经干细胞定向分化，而这可能与Wnt/β-catenin 通路的激活密切相关。由于 Wnt/β-catenin 信号通路与其他信号通路存在交叉信号，本团队已在进行相关研究。总之，补肾益脑灸法可以调节wnt信号通路关键蛋白GSK-3β、β- catenin及其mRNA的表达水平，对围绝经期抑郁症模型大鼠海马神经干细胞定向分化起到良性调整作用。

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MoxibustionInfluenceTheNeurogenesisofHippocampalinOvariectomizedandChronicUnpredictableMildStressRatsViaWnt/Beta-cateninSignalingPathway

DENG Xue1, REN Lu1△, LENG Xue1, ZHANG Nan2, WANG Xu1

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847; 2.ChineseMedicalSciencesUniversity,Shenyang110122,China)

Objective: To observe the expression of neural stem cell differentiation markers on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampus; to explore the mechanism of moxibustion treatment for nourishing “Kidney - Brain System”.Methods： 60 rats were randomly divided into five groups: a normal group, a model group, a sham operation group, a western medicine group, and a suspended moxibustion(SM) group. A perimenopausal depressive rat’s model was made by castration and chronic unpredictable stress combination. The treatments were for 28 days. The general condition of rats, the rat’s estrous cycle, the weight of rats, and sugar consumption experiment of rats were observed. GFAP, Tuj-1, GSK-3 beta and beta-catenin in rat’s hippocampus tissue were detected by Elisa. RT-PCR method was used to detect the expression of GSK-3βmRNA and β-catenin mRNA in the rat’s hippocampus.Results: After modeling, except the normal group, the depressive behavior of all other groups was showed , however, after treatment，the depressive behavior of rats was dramatically reduced. Compared with the model group, the expression of GSK-3, GSK-3, mRNA and GFAP in the rat’s hippocampus of western medicine group, moxibustion group and sham operation group was increased, Tuj-1, beta -catenin and beta mRNA -catenin expression was reduced. Conclusion: Moxibustion treatment could nourish “Kidney - Brain System” through changing the expression of GSK-3β and β-catenin on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampal and through regulating the directional differentiation of neural stem cells in the hippocampus. Moxibustion has effect on the treatment of perimenopausal depression.

Bushen Yinao moxibustion; Perimenopausal depression; GFAP; Tuj-1 GSK-3β; β-catenin

国家自然科学基金资助项目(81373718)-基于“肾脑相济”理论探讨电针诱导脑海马内源性神经干细胞分化治疗围绝经期抑郁症的作用;国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB530401973)-中医“肾精命火”脏象理论相关疾病与证候的研究;国家自然科学基金资助项目(81503273)-黄连素促进海马神经发生治疗糖尿病脑病认知障碍的机制研究;辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(LR2014027)-基于“肾脑相济”理论探讨电针对更年期抑郁症cAMP/PKA-CREB-BDNF信号通路的调节作用;中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室

邓 雪(1986-),女,山东淄博人,医学博士，从事针刺机理的现代研究。

任 路(1966-),女，教授，医学博士，博士研究生导师，从事针灸治疗心身疾病的机制研究，Tel:13700016613,E-mail:inzyxkc@sina.com。

R245.81

B

1006-3250(2017)09-1288-04

2017-03-27