QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定3种叶菜中矮壮素和丙环唑残留

叶 倩, 黄健祥， 骆 冲, 路大海, 邓义才, 孙 玲*

(1.广东省农业科学院农产品公共监测中心,广东广州 510640；2.农业部农产品质量安全风险评估实验室(广州),广东广州 510640；3.农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室,广东广州 510640)

植物生长调节剂在农业生产中具有增强作物抗逆性、改善品质、增加产量等作用[1]。矮壮素和丙环唑作为植物生长调节剂，近年来被用于控制菜心等叶菜的外形，促进茎叶粗壮和叶色深绿，增加产量和提高品质。目前我国尚未对矮壮素或丙环唑在叶菜中残留限量做出规定，也无叶菜中其残留测定的标准方法。因此，探讨并建立检测叶菜中矮壮素和丙环唑残留标准具有实际意义。日本肯定列表规定，矮壮素和丙环唑在菜心、芥蓝和小白菜中的限量均为0.05 mg/kg[2]。矮壮素的检测方法目前主要采用液相色谱-质谱(LC-MS)法[3 - 4]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[5 - 12]。这些分析方法的应用范围包括蔬菜、水果、果汁、土壤、谷物及小鼠肌肉等样品。采用的样品处理方法常为有机溶剂提取结合阳离子交换柱净化，但存在操作繁琐、消耗时间长等不足。近年来，丙环唑的分析研究报道中，越来越多采用LC-MS/MS法[13 - 19]，应用于蔬菜、水果、土壤、水、酒及婴儿食品等样品。叶菜的基质成分复杂，分离分析难度大，检测干扰严重。叶菜中矮状素和丙环唑同时测定的方法尚未见于报道。

QuEChERS技术具有快速、高效等优点，被广泛运用于农药残留分析的前处理过程中。LC-MS/MS具有高通量、高选择性和高灵敏度等特点，是农药残留分析的热点技术之一。本文以芥蓝、菜心、小白菜为研究对象，优化了QuEChERS前处理条件、色谱条件和质谱条件等，建立了基于LC-MS/MS法的叶菜中矮壮素和丙环唑残留的分析方法。并利用该方法分析了市场上流通的叶菜样品。该方法具有快速、简便、准确等特点，满足叶菜中农药残留分析的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCMS-8050三重四极杆质谱，配岛津LC-30AD超高效液相色谱(日本，Shimadzu公司)，电喷雾离子源(ESI)；VX-200涡旋仪(美国，Labnet公司)；高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Milli Q超纯水系统(美国，Millipore)。

1 000 mg/L矮壮素、丙环唑溶液(纯度≥99.0%，农业部环境质量监督检验测试中心)，用乙腈配制成100 mg/L的储备液，-20 ℃保存。使用不含待测化合物的菜心、芥蓝、小白菜空白基质将矮壮素配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L系列基质标准溶液；丙环唑配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列基质标准溶液。乙腈和甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma公司)；C18、石墨化碳黑(GCB)、Florisil净化剂(天津博纳艾杰尔公司)；PSA净化剂(美国Agilent公司)；HAc、无水HgSO4、无水NaAc均为分析纯。尼龙66微孔过滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。

芥蓝、菜心和小白菜样品购自本地市场。

1.2 样品前处理

样品去除枯黄叶片，组织经匀浆机匀浆后，低温保存备用。称取10.00 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL含1%HAc的乙腈溶液，加入4.00 g无水MgSO4和1.00 g无水NaAc，涡旋振荡3 min，再以4 500 r/min 离心5 min。取5 mL上清液于10 mL离心管中(内含75 mg PSA、425 mg无水MgSO4、50 mg C18)，涡旋混匀1 min后，以4 500 r/min离心5 min，取上清液以0.22 μm尼龙66滤膜过滤，待测定。

1.3 UPLC-MS/MS条件

色谱条件：色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODSⅢ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)。流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈。梯度洗脱程序：0.5～2 min,10%B；2～5 min,10%～95%B；5～7 min,95%B；7.1 min,10%B。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

质谱条件：采用ESI离子源，正离子多反应监测(MRM)模式检测。雾化气流速：3 L/min；加热气流速：10 L/min；干燥气流速：10 L/min；离子源接口温度：300 ℃；脱溶剂温度：250 ℃。矮壮素、丙环唑的质谱检测参数见表1。

表1 矮壮素和丙环唑质谱检测参数

*quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

矮壮素、丙环唑在进入一级质谱后，可产生稳定的[M+H]+离子，该离子即为两种植物生长调节剂的母离子。在Product Scan模式下，对化合物母离子施加一定的碰撞能(CE)，母离子发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片，进入二级质谱。最后在MRM模式下，优化Q1、Q3电压及目标物离子碎片的碰撞能量。两种植物生长调节剂的二级离子质谱图见图1。

图1 矮壮素(A)和丙环唑(B)的二级离子质谱图Fig.1 MS/MS spectra of chlormequat (A) and propiconazole (B)

2.2 色谱条件优化

实验了SHIMADZU-GL Inertsil HILIC(150×2.1 mm,3 μm)、Phenomenex HILIC柱(100×2.1 mm,2.6 μm)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ柱(75×2.0 mm,1.6 μm)3种色谱柱对待测物的分离效果。结果表明矮壮素和丙环唑在SHIMADZU-GL HILIC柱和Phenomenex HILIC柱两种色谱柱上的分离重现性以及峰形较差。矮壮素为强极性化合物，在Shim-pack XR-ODS Ⅲ色谱柱上保留时间小于1 min。多次实验表明，矮壮素和丙环唑在该柱的分离重现性以及峰形都达到检测所需的要求，因此选取Shim-pack XR-ODS Ⅲ色谱柱。

实验对比了有机相：乙腈/甲醇与水相：0.1%甲酸溶液/0.3%甲酸溶液/20 mmol/L NH4Ac溶液六种组合，考察其对目标物的分离效果及灵敏度的影响。结果表明：有机相为乙腈，水相为0.1%甲酸溶液时待测物的分离效果和灵敏度都比较好。

2.3 提取溶剂的选择

根据矮壮素和丙环唑的性质，以不含待测化合物的菜心为基质，对比了乙腈、含1%HAc的乙腈和含1%HAc+49%水的乙腈溶液的提取效果。如图2所示，使用含1%HAc的乙腈溶液为提取溶剂时，矮壮素和丙环唑的回收率均可达到80%，满足农药定量分析要求[20]。实验采用含1%HAc的乙腈溶液为提取溶剂。

2.4 吸附剂的优化

以不含待测化合物的菜心为基质，对比了PSA、C18、GCB、Florisil和无水MgSO4+PSA+C18的净化效果。如图3所示，使用无水MgSO4+PSA+C18混合吸附剂时矮壮素和丙环唑的回收率都达到80%以上，满足农药定量分析要求[20]。最终采用无水MgSO4+PSA+C18混合吸附剂对样品进行净化处理。

图2 提取溶剂对矮壮素和丙环唑回收率的影响Fig.2 Effect of extraction solvents on recoveries of chlormequat and propiconazole

图3 吸附剂对矮壮素和丙环唑回收率的影响Fig.3 Effect of adsorbents on recoveries of chlormequat and propiconazole

2.5 线性方程、检出限和定量限

采用1.2节的方法对不含待测化合物的菜心、芥蓝、小白菜进行前处理，得到三种空白基质以配制标准溶液。以待测物浓度为横坐标(x)，定量离子对的色谱峰面积为纵坐标(y)获得矮壮素和丙环唑的工作曲线。两种化合物的线性方程、检出限(信噪比S/N=3)(LOD)和定量限(LOQ)见表2，矮壮素和丙环唑的定量限LOQ为添加的最低浓度0.010 mg/kg，满足菜心、芥蓝、小白菜中矮壮素和丙环唑残留安全检测的要求[2]。

表2 矮壮素、丙环唑的线性方程、检出限和定量限

2.6 方法回收率和精密度

称取经测定不含矮壮素和丙环唑的空白样品10.00 g，分别对应添加0.010、0.10和0.50 mg/kg 3个浓度水平的混合标准溶液。涡旋混匀后放置过夜12 h，按照1.2节进行前处理。每个添加浓度水平重复3次测定，考察方法回收率和精密度，结果见表3。方法准确度和精密度均符合残留分析要求。菜心中矮壮素和丙环唑的色谱图如图4所示。

表3 矮壮素、丙环唑在叶菜中的添加回收率(n=3)

图4 加标菜心样品中矮壮素(1)和丙环唑(2)的液相色谱-串联质谱图Fig.4 Liquid chromatography-tandem mass spectrometric chromatograms of chlormequat(1) and propiconazole(2) in spiked flowering Chinese cabbage samples(a) blank extract；(b) standard solution of 10 μg/L；(c) sample spiked with 10 μg/kg.

采用本方法分析了市面上销售的芥蓝、菜心和小白菜各5个样品共15例。所有样品均未检出矮壮素；1个芥蓝和1个菜心样品中检出有丙环唑，检出值分别为2 μg/kg和4 μg/kg,低于定量限。

3 结论

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS快速测定3种叶菜中矮壮素和丙环唑的分析方法。对比现行的国家标准(GB/T 20769-2008)中的样品前处理方法，本文中所用的QuEChERS法操作简单、步骤少、时间消耗低，能有效去除蔬菜基质干扰；方法的灵敏度、准确度和精密度等满足农药残留检测的要求，适用于叶菜中矮壮素和丙环唑残留的快速同时分析。