辣椒渣鲜味肽初步分离纯化研究

罗凤莲，王 燕，赵 静

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.国家蔬菜加工技术研发分中心，湖南长沙 410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙 410128）

辣椒渣鲜味肽初步分离纯化研究

罗凤莲1，2，3，*王 燕1，2，3，赵 静1

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.国家蔬菜加工技术研发分中心，湖南长沙 410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙 410128）

以辣椒渣为原料，将辣椒渣中蛋白提取出来，采用风味酶和复合蛋白酶进行酶解得到蛋白酶解液，然后将辣椒渣酶解液进行初步分离纯化和感官评价，获得辣椒渣目标鲜味肽的相对分子质量范围为307.32～1 422.69 Da，鲜味评分为8.0分，综合风味评分为4.1分。

辣椒渣；鲜味肽；酶解；分离纯化

Abstract：With chili residue as raw material，chili residue protein is extracted and later is hydrolyzed by protamex and flavorzyme.Then chili residue hydrolysates are isolated and purified and then sensory evaluated.The relative molecular mass of obtained chili residue umami peptide is range from 307.32～1 422.69 Da，with umami score 8.0 and comprehensive flavor score 4.1.

Key words：chili residue；umami peptide；enzymatic hydrolysis；isolation and purification

0 引言

辣椒渣（又名辣椒粕） 是红辣椒深加工提取辣椒红色素和辣椒素后剩余的渣料，辣椒渣得率为原料干辣椒的80%左右。辣椒渣含有极少量的红色素、辣椒玉红素、胡萝卜素、玉米黄素、VC及辣椒碱类物质。另外，还含有蛋白质、脂肪、糖类、VB1，VB2及多种矿物质，其蛋白质含量可达14%～19%，并含有大量人体所必需的氨基酸和鲜味氨基酸[1-2]。

我国辣椒资源非常丰富，辣椒深加工企业有1 000余家，辣椒渣的产量也较高。辣椒渣具有杀菌、增加畜禽肠内有益菌群、减少肠炎发病率、提高畜禽抗病能力等作用[3-6]。目前，辣椒渣主要用来作饲料或作为生产废料被直接丢弃，造成了极大的资源浪费。

由于辣椒渣中蛋白质含量丰富，是非常宝贵的食品资源。因此，试验以辣椒渣为原料，将辣椒渣蛋白提取出来，进行酶解处理，以具有鲜味的辣椒肽为考查目标，参照预试验确定的最佳酶解工艺条件，采用风味酶和复合蛋白酶进行双向酶解，制得富含鲜味肽的蛋白酶解产物。利用超滤、凝胶过滤层析等现代分离纯化手段对辣椒渣蛋白酶解产物初步分离纯化，然后采用感官评价法对目标辣椒渣鲜味肽的鲜味、风味进行评价。此研究将为辣椒渣蛋白的利用提供理论依据，使辣椒渣变废为宝，大大地提高辣椒渣的附加值，而且还可以增加鲜味剂的来源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

风味酶（200 U/mg）、复合蛋白酶（120 U/mg），上海楷洋生物科技有限公司提供；辣椒渣分离蛋白，蛋白质含量59.14%，实验室自制；葡聚糖凝胶Sephadex G-15型树脂，北京瑞达恒辉科技发展有限公司提供；D45 mm透析袋（截留分子质量8 000～14 000 U），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；杆菌肽（Mr=1 422.69 Da）、还原型谷胱甘肽GSH（Mr=307.32 Da）、二甘氨酰甘氨酸Gly-Gly-Gly（Mr=189.17 Da），美国Amresco公司提供。

氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿、盐酸、硼砂、甲醛、无水硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、硼酸、单宁、柠檬酸等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

FW177型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；AUY220型分析天平，日本岛津公司产品；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海飞越实验仪器有限公司产品；KDN-103F型定氮仪，上海纤检仪器有限公司产品；TDZ5型台式低速离心机，湖南赫西装备仪器有限公司产品；GL-3250B型磁力搅拌器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；FD-1B型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；HD-3型紫外检测器、DHLA型恒流泵、层析柱（0.8 cm×80 cm）、HD-A型电脑采集器，上海沪西分析仪器厂产品；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；Ultra-15型离心超滤管，上海北诺生物科技有限公司产品。

1.3 试验方法

在G20杭州峰会开幕主旨演讲中，习总书记是这样介绍杭州的：“杭州是中国的一个历史文化重镇和商贸中心，有千年以上的历史。千百年来，从白居易到苏东坡，从西湖到大运河，杭州的悠久历史和文化传说引人入胜。杭州是创新活力之城，电子商务蓬勃发展，在杭州点击鼠标，联通的是整个世界。杭州也是生态文明之都，山明水秀，晴好雨奇，浸透着江南韵味，凝结着世代匠心。”

1.3.1 辣椒渣分离蛋白的提取及蛋白酶解液的制备

辣椒渣→粉碎，过100目过筛→采用超声辅助碱溶法提取（选择超声功率250 W，超声温度50℃，超声时间4 h，NaOH碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶20） →离心（以转速3 000 r/min离心15 min） →收集上清液→稀盐酸调节pH值3.6→离心（以转速3 000 r/min离心15 min） →收集沉淀，经透析袋脱盐→冷冻干燥（温度-50℃，时间10 h），即为辣椒渣分离蛋白[2，7]。

将辣椒渣分离蛋白和水按照1∶10的比例混合均匀，在风味酶和复合蛋白酶质量比为1∶2，总酶用量为2%（以辣椒渣分离蛋白的质量计算），选择预试验确定的最佳条件（酶解时间6 h，pH值6.5，酶解温度50℃）进行酶解，获得辣椒渣蛋白酶解液。

1.3.2 辣椒渣蛋白酶解液的超滤分离

采用离心超滤管对辣椒渣蛋白酶解液进行超滤分离。超滤膜的可截留分子量一般包括1，3，5，10 kDa等不同大小的分子量。一般来说，食源性蛋白中的呈味肽，其分子量均小于5 kDa[8-9]。预试验结果也表明辣椒肽分子量较小，故选用3 kDa的超滤膜进行分离。首先，将酶解液通过0.45 μm的微孔滤膜，然后使用离心超滤管（截留分子量为3 kDa）对酶解液进行超滤，收集好大于3 kDa和小于3 kDa两部分滤液，冷藏备用。

1.3.3 辣椒渣蛋白酶解液的凝胶过滤层析分离[10-11]

经过预试验，选择葡聚糖凝胶SephadexG-15为最终填充柱材料。称取5 g葡聚糖凝胶SephadexG-15，加200 mL蒸馏水，于室温下溶胀6 h，达到溶胀平衡后将悬浮在液体表面的小颗粒倾泻倒出，静置过夜，弃去多余的蒸馏水，使葡萄糖凝胶质量分数为50%～70%。然后，参照文献的方法进行操作，得到凝胶过滤层析液。

1.3.4 辣椒渣鲜味肽的分子量估测

采用还原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、杆菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 为标准品，分别配制质量浓度为10 mg/mL的肽标准溶液。准确移取1 mL肽标液使通过葡聚糖凝胶SephadexG-15层析柱，再进行洗脱，采用紫外检测器和电脑采集器绘制图谱。将标准品的洗脱出峰时间与样品的洗脱出峰时间进行对比，初步估计辣椒渣鲜味肽的相对分子质量范围。

1.3.5 辣椒渣鲜味肽的感官评价方法

选择柠檬酸（代表酸味）、蔗糖（代表甜味）、盐酸奎宁（代表苦味）、谷氨酸钠（代表鲜味）、氯化钠（代表咸味）做感官评价呈味基准物质，按照呈味阈值浓度（柠檬酸0.001 2%，白砂糖0.5%，盐酸奎宁0.000 05%，谷氨酸钠0.15%，氯化钠0.08%）[12]、2倍呈味阈值浓度、4倍呈味阈值浓度、6倍呈味阈值浓度配制标准使用液，依次代表起始味道（Threshold）、轻微（Slight）味道、一般（Modetate）味道、较强（Strong）味道，然后对辣椒渣酶解液进行感官评价。挑选7名对味道很敏感的评价员（4男3女），反复训练使记住基准物质味道，再根据基准物质味道对试验样品的味道分别进行评判，并在呈味强度标尺相应的位置标记酸、甜、苦、鲜、咸的程度，5种味道评分取值范围设定在0～15分，最后对所得数据采用加权法计算总分。

呈味强度标尺（起始、轻微、一般、较强） 见图1，感官评价综合评分权重系数见表1。

图1 呈味强度标尺（起始、轻微、一般、较强）

表1 感官评价综合评分权重系数

2 结果与分析

2.1 酶解液的超滤分离

辣椒渣蛋白经过风味酶和复合蛋白酶的双酶水解之后，获得辣椒渣蛋白酶解液，再经过超滤分离后得到分子量小于3 kDa和分子量大于3 kDa的2种组分，进行感官评价。测得经超滤分离截留分子量小于3 kDa的组分鲜味更加明显，综合风味也更好。因此，选择截留分子量小于3 kDa的组分进一步进行分离纯化。

超滤分离后2种组分的感官评价结果见表2。

表2 超滤分离后2种组分的感官评价结果/分

2.2 辣椒渣蛋白酶解液的凝胶过滤层析分离纯化

对超滤后分子量小于3 kDa的组分Ⅰ继续进行凝胶过滤分离纯化，选用凝胶SephadexG-15，进样量1 mL，上样浓度25 mg/mL，以蒸馏水为洗脱液，洗脱速度30 mL/h，得到3个洗脱峰A，B，C，以感官评分进行结果评定。

辣椒渣蛋白酶解液的凝胶过滤层析见图2，凝胶过滤层析后不同组分的感官评价结果见表3。

图2 辣椒渣蛋白酶解液的凝胶过滤层析

表3 凝胶过滤层析后不同组分的感官评价结果/分

测得A组分的鲜味评分为5.0分，综合风味评分为2.0分；B组分的鲜味评分为8.0分，综合风味评分为4.1分；C组分的鲜味评分为6.0分，综合风味评分为2.9分。因此，选择B组分为目标鲜味肽。

2.3 辣椒渣鲜味肽分子量的估测

辣椒渣鲜味肽B组分与还原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、杆菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 标样在相同凝胶过滤层析条件下比较，依据其出峰时间可以初步判定，辣椒渣鲜味肽B组分的相对分子质量范围为307.32～1 422.69 Da。

3 结论

试验选择复合蛋白酶和风味酶酶解辣椒渣蛋白，采用超滤法对辣椒渣蛋白酶解液进行第一步分离提纯，感官评价结果表明分子量小于3 kDa的组分鲜味更加明显，综合风味也更好。采用凝胶过滤层析法作进一步分离纯化，最终得到较纯的辣椒渣鲜味肽ⅠB组分，其相对分子质量范围为307.32～1 422.69 Da，鲜味评分为8.0分，综合风味评分为4.1分。

[1]杨清香，葛亮，潘锋，等.辣椒资源开发利用状况 [J].农产品加工（学刊），2010（10）：80-82.

[2]唐鑫媛，夏延斌，文新昱，等.超声波辅助碱法提取辣椒渣中蛋白质的工艺优化 [J].食品与机械，2015，31（2）：222-226.

[3]李万峰.辣椒粕的营养价值与作用 [J].农村养殖技术，2012 （23）：44.

[4]王东海，铁鑫，赵芸君，等.新疆辣椒粕在畜牧养殖业的应用分析及前景展望 [J].草食家畜，2015（4）：35-39.

[5]Sowbhagya H B，Soumya C，Indrani D，et al.Physicochemical characteristics of chilli spent residue and its effect on the rheological，microstructural and nutritional qualities of bread[J].Journal of Food Science and Technology，2015，52 （11）：7 218-7 226.

[6]Luana P Cruz，Suzanna F F Ribeiro，Andre O Carvalho，et al.Isolation and partial characterization of a novel lipid transfer protein（LTP） and antifungal activity of peptides from chilli pepper seeds[J].Protein&Peptide Letters，2010，17 （3）：311-318.

[7]赵静，王燕.辣椒粕分离蛋白酶解工艺条件的优化 [J].食品与机械，2016，32（1）：162-166.

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[11]尹歆.鲢鱼蛋白制备ACE抑制肽的工艺及其活性研究 [D].长沙：湖南农业大学，2012.

[12]夏延斌，王燕.食品化学 [M].北京：中国农业出版社，2015：25-28.◇

Preliminary Isolation and Purification of Chili Residue Umami Peptide

LUO Fenglian1，2，3，*WANG Yan1，2，3，ZHAO Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hu'nan Agricultural University，Changsha，Hu'nan 410128，China；2.National R＆D Center for Vegetable Processing，Changsha，Hu'nan 410128，China；3.Hu'nan Provincial KeyLaboratoryofFood Science and Biotechnology，Changsha，Hu'nan 410128，China）

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.028

1671-9646（2017） 09b-0008-03

2017-07-06

湖南省科技重大专项子项目“蔬菜贮藏保鲜和加工新技术以及功能成分高效综合利用研究与示范”（2015NK1003）。

罗凤莲（1973— ），女，博士，副教授，研究方向为食品分析与营养。

*通讯作者：王 燕（1968— ），女，博士，教授，研究方向为食品功能成分和食品添加剂。