GC—TOF MS结合化学计量学用于安化黑茶的识别

颜鸿飞 彭争光 李蓉娟 陈 练 王美玲 付善良 戴 华 张 帆,4

(1. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙 410004；2. 湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙 410100；3. 东港出入境检验检疫局，辽宁 东港 118300； 4. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004)

GC—TOF MS结合化学计量学用于安化黑茶的识别

颜鸿飞1,2彭争光2李蓉娟3陈 练1,2王美玲1,2付善良1,2戴 华1张 帆2,4

(1. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙 410004；2. 湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙 410100；3. 东港出入境检验检疫局，辽宁 东港 118300； 4. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004)

采用顶空固相微萃取联合气相色谱—飞行时间质谱(GC—TOF MS)对安化黑茶及其它产地黑茶中的挥发性成分进行检测，对41种共有挥发性组分进行定性定量分析。应用化学计量学统计工具对数据进行变量筛选、主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，筛选出安化黑茶的26个显著性差异香气成分，通过主成分得分投影图直观反映样本间的聚类趋势和分类信息，对安化黑茶与不同产地黑茶样品及其它种类茶叶进行有效区分和识别，找出14个对安化黑茶识别分类起着重要作用的挥发成分。结果表明，基于茶叶中挥发性成分差异的GC—TOF MS分析结合化学计量学统计方法用于安化黑茶识别是可行的。

顶空固相微萃取；气相色谱—飞行时间质谱；主成分分析；偏最小二乘判别分析法；安化黑茶；识别

Abstract： The volatile components in Anhua and other dark teas were analyzed by headspace solid phase microextraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-time of flight mass spectrometry (GC-TOF MS). About 41 volatile compounds were analyzed qualitatively and quantitatively. A classification model and predict the authenticity obtained from variance analysis, principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminate analysis (PLSDA). In addition, the 26 compounds significant impacting on the classification were screened out from Anhua dark tea. The straight forward classification trend of Anhua dark tea and other samples was visualized through projection score plots obtained by PCA. Effective classification and identification of Anhua dark tea, other origin dark tea and other kinds were carried out. The 14 important components for classification were found. The results showed that the developed GC-TOF MS method combined with chemometrics based on the volatile components in tea could be used to discriminate Anhua dark tea.

Keywords： gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF MS); principal component analysis (PCA); partial least squares discriminate analysis (PLSDA); volatile components; Anhua dark tea; discriminate

湖南安化黑茶的独特品质和保健功能逐渐被人们所认同，成为国内外茶叶市场的新贵，深受广大消费者青睐[1]。但黑茶生产门槛低，一直没有完整的标准体系，导致市场上的安化黑茶品质良莠不齐。部分茶商用外路劣质茶叶加工成冒牌“安化黑茶”进行销售，既损害了消费者的利益，也给安化黑茶质量和声誉带来了严重影响，在一定程度上阻碍了湖南黑茶产业的国际化进程。因此，有必要开发安化黑茶的识别表征技术，以保护安化产区黑茶独特品质, 为安化黑茶的质量控制、品质量化及原产地保护提供一种科学的技术手段，促进湖南黑茶产业的持续健康发展[2]。

目前，茶叶鉴别方法主要为感官评定和简单理化指标检测方法，感官评定结果主观性强，易受个体感官差异、主观情绪、环境等因素的影响。同样，常规理化指标检测方法无法全面反映茶叶的整体特征，难以进行正确识别[3]。随着高通量、高灵敏度、高分辨率的仪器分析技术的发展，为获得茶叶的全组分信息提供了可能。但现代科学分析技术在对样品进行多元分析的同时会产生大量的多参量高维数据，传统分析化学数据处理方法难以对海量多维化学量测数据进行充分的信息提取、挖掘与利用。因此，利用现代分析仪器获得样品组分信息，再结合化学计量学统计分析工具来进行数据分析以最大程度获取有用信息，在样品成分信息差异、地域特征和品质特性之间建立起有效关联，通过构建识别模式和特征标记物筛选方法，已经成为茶叶产地[4-5]、种类[6-7]、等级[8-9]的鉴别与分类研究的重要模式。已有一些研究者通过分析茶叶中香气成分来进行分类[10-11]和识别的研究[12-13]，但尚未见运用HS—SPME技术萃取香气物质结合化学计量学方法用于安化黑茶产地识别的研究报道。本研究采用自动顶空固相微萃取(HS—SPME)技术萃取安化黑茶的香气物质，利用气相色谱—飞行时间质谱联用仪(GC—TOF MS)同时测定安化黑茶香气全组分，采用方差分析筛选得到表征湖南安化黑茶香气品质的特征成分，结合最常用的两种化学计量学统计方法—主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)将GC—TOF MS原始数据进行降维、特征量提取和建立分类模型，区分安化黑茶与其它产地黑茶及其它类别茶叶，找出对安化黑茶识别分类起着重要作用的挥发成分，为安化黑茶的产地识别和质量监控提供了新的研究方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

安化黑茶：44个样品，购自湖南安化县茶厂；

其他茶叶：购自湖南茶叶市场，其中臧茶样品4个，普洱茶样品10个，乌龙茶样品10个，红茶样品7个和绿茶样品5个。

SPME萃取头：2 cm，30/50 μm (DVB/CAR/PDMS) 型，美国色谱科公司。

1.2 试验设备

气相色谱—飞行时间质谱仪：Pegasus 4D型，美国力可公司；

样品前处理多功能全自动进样系统：Combi PAL型，瑞士思特斯公司；

分析天平：ML204型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取 参照文献[14]，修改如下，称取茶叶样品2.0 g于25 mL固相微萃取瓶中，用带聚四氟乙烯瓶垫的钳口铝盖对萃取瓶进行封口密封，然后将萃取瓶置于样品前处理多功能全自动进样系统的样品架上。样品前处理多功能全自动进样系统操作步骤：首先将萃取瓶放入加热孔中80 ℃恒温振荡平衡20 min后，插入固相微萃取针，伸出萃取纤维头，在600 r/min搅拌下进行顶空萃取1 h。固相微萃取吸附完成后，取出立即插入色谱进样口，温度250 ℃下解吸附5 min，同时触发气相色谱—飞行时间质谱仪进行数据采集。固相微萃取头在下次使用前需在气相色谱进样口280 ℃下加热老化至少1 h。

1.3.2 GC—TOF MS分析 色谱柱：Rtx-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；分析条件：参照文献[14]。

1.4 定性和定量方法

1.4.1 定性分析 由GC—TOF MS分析得到的质谱数据经工作站ChromaTOF软件与NIST 11 LIB标准谱库自动进行识别和匹配检索，仅选出匹配度≥80%的峰物质，生成质谱峰列表数据，再进一步结合分子量、结构式、质谱图等信息及有关文献报道来确定各出峰物质的成分。

1.4.2 定量分析 通过色谱工作站对总离子色谱图进行自动积分和峰面积计算，然后通过人工核对色谱峰积分效果仔细核对。若有积分不准确的情况，应修改积分参数后重新自动积分，以避免积分重复和不合理情况或者通过手工积分的方式取得各挥发性成分的可靠含量。设定积分阈值使相对含量<0.01%的峰不进行积分计算。相对峰面积采用峰面积归一化法进行计算，得到各物质组分的相对百分比含量。

1.5 数据处理方法

运用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5 软件进行数据的变量筛选、主成分分析和偏最小二乘判别分析等统计分析。

2 结果与分析

2.1 安化黑茶香气成分特征分析

HS—SPME萃取香气化合物后，经GC—TOF MS检测，采用ChromaTOF软件按1.4标准进行筛选,筛选得到的黑茶样品41个共有组分见表l。其中，3,5-辛二烯-2-酮(E,E)、反,反-2,4-庚二烯醛、和6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等烯类化合物是形成安化黑茶独特发酵香味“菌花香”的重要物质成分[15]。2-戊基呋喃、香叶基丙酮等对安化茯砖茶具有独特烘焙香或火功香味有重要贡献[16]。为找出安化黑茶的特征香气成分，根据黑茶样品的产地来源将茶样中安化黑茶归为一类，其它产地黑茶归为另一类。以不同茶叶中的41个共有香气物质相对含量为变量，进行方差分析见表1，安化黑茶与非安化黑茶主要的差异性成分为：2,6,10-三甲基十二烷、2-戊基呋喃、alpha-松油醇、反2-(2-戊基)呋喃、β-紫罗酮、1,2,3-三甲氧基苯、3,5-辛二烯-2-酮(E,E)、甲基庚烯酮、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛、反,反-2,4-庚二烯醛、香叶基丙酮、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、苯乙酮、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺(4 ,5)癸-6,9-二烯-2,8-二酮、藜芦醚、2-甲基十七烷、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、α-姜黄烯、2,3,5,8-四甲基癸烷、苯甲醛、藏花醛、2,3,5,6-四甲基吡嗪、紫罗烯、1,3-二叔丁基苯、3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯。这些差异性香气成分共同构成了湖南安化黑茶独特的香气品质特征。

2.2 主成分分析

方差分析只能对两大类型茶样香气成分差异的总体情况进行评估，无法对各香气成分在各茶叶样品的分布规律及特征进行比较分析，为此需要进一步进行多变量分析处理。主成分分析作为最常用的多元统计方法可将高维数据投影到较低维空间，用较少的综合指标反映原始指标从而解析出主要影响因素，还可根据主成分得分图分析各类样本的分布规律用于品种分类[17]、产地溯源[18]和品质分级[19]等研究。本试验以安化黑茶的26个显著性差异香气成分的峰面积相对百分比作为变量，建立数据矩阵，运用SIMCA P 11.5进行PCA分析，安化黑茶和其它产地黑茶样品在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)上的主成分得分投影图(图1)，能够直观地反映样本间的相似或差异性。由图1可知，安化黑茶和其它产地黑茶样品二维空间中的分布呈现出一定程度的类别聚集趋势，但分布较为分散,存在部分样品相互交叉重叠，两个类别样品并没有完全分离，识别效果不太理想。由表2可知，主成分的特征值大于1的有8个，但累积贡献率不足80%，前3个主成分的累积方差贡献率为50.492%，这可能使得主成分分析方法在本应用中存在信息量提取不足、特征向量方向不确定等问题，难以实现对安化黑茶、其它产地黑茶的有效区分。

表1 安化黑茶的共有香气物质

2.3 偏最小二乘判别分析

偏最小二乘法判别分析法作为一种新型的多元统计数据分析方法，具有主成分分析、典型相关分析和多元回归分析等多种功能，可以消除相互重叠的数据信息，尤其是当自变量个数大于观察量个数时，其数据分析结果更加准确可靠。为寻找更为有效的安化黑茶识别分析方法，本研究尝试利用PLS—DA的分析方法进行判别分析。PLS-DA分析同样将安化黑茶的26个显著性差异香气成分的相对峰面积百分比作为变量，建立数据矩阵，根据已知的茶叶信息将样本预先分为3个类别即类别1(安化黑茶)、类别2(其它产地黑茶)和类别3(其它类别茶叶包括绿茶、红茶、乌龙茶)，进行偏最小二乘法判别分析，所得OPLS-DA图，见图2。通过每个样本点在PLS-DA得分图上的相对位置和分布情况来显示样本的分类信息，从而达到样品识别的目的。图2(a)直观显示了安化黑茶与其它产地黑茶较为集中地分布在各自特征区域，基本可以将所有样本分为两组,基本以PC1=-2为界显著分开，两个类别的茶叶基本分离，实现对安化产地黑茶与其它产地黑茶的较好识别。同样使用该方法对类别1(安化黑茶)、类别3(其它类别茶叶)进行了识别分析[见图3(b)]，发现两类茶叶样本完全分离，类别聚集更加明显，可以将所有样本分为两组，基本以PC1=-1为界显著分开，表明第一个主成分对于区分这两个类别茶叶起了主要的区分作用。此外，还运用该模型同时对3类茶叶进行了识别分析[见图2(c)]，从样品点的分布趋势来看，3个类别的茶叶相对集中地聚集在各自独立的特征区域, 呈现出较好的类聚效应，可以将所有样本分为3个组别，各组别分布区域界限较明显。以PC1=0为界明显分开，类别1集中分布在PC1>0的区域，类别2和类别3集中分布在PC1<0的区域，第一个主成分起了主要的区分作用。另外，类别3与另外两个类别茶叶也存在一定的分布特征区域，有较好的分离效果。基本上以PC2=1为界明显区分开来，类别1和类别2)较为集中分布在PC2<1的区域，类别3较为集中分布在PC2>1的区域，说明第二个主成分起了主要的区分作用。所以只要将未知样品经上述方法处理得到其投影得分值及模型空间内的分布区域和位置，就可对其种类进行识别。以上结果表明，本研究采用OPLS-DA的分类识别效果明显优于主成分分析结果，可用于安化黑茶的产地识别及分类。

表2 主成分的方差贡献率

图1 黑茶样品的主成分得分投影图

图2 茶叶样品OPLS-DA分析结果图

2.4 成分变量重要性分析

进一步运用PLS-DA对类别1(安化黑茶)、类别2(其它产地黑茶)两类样本进行变量重要性评分，分析计算出PLS-DA变量重要性因子(Variable important for the projection，VIP)分值，可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，VIP 值越大，变量在两个类别中的差异越显著，得到VIP值>1的理化成分有14个，按照分值大小顺序依次为2,6,10-三甲基十二烷、alpha-松油醇、2-戊基呋喃、β-紫罗酮、反2-(2-戊基)呋喃、1,2,3-三甲氧基苯、甲基庚烯酮、3,5 - 辛二烯-2-酮(E,E)、香叶基丙酮、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛、反,反-2,4-庚二烯醛、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、2,3,5,8-四甲基癸烷和2,3,5,6-四甲基吡嗪。

3 结论

采用顶空固相微萃取结合GC—TOF MS分析茶叶中挥发性成分，利用主成分分析法与偏最小二乘判别法实现了不同茶叶的识别区分，获得了对分类判别贡献较大的14个挥发性成分。结果表明，基于茶叶中挥发性成分差异的GC—TOF MS分析结合化学计量学统计方法用于湖南安化黑茶识别是可行的。筛选出的差异性挥发性成分在安化黑茶中的分布规律及扩展该分析方法的应用领域有待进一步分析和研究。

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Discrimination of Anhua dark tea by gas chromatography-time of flight mass spectrometry combined with chemometrics

YAN Hong-fei1,2PENGZheng-guang2LIRong-juan3CHENLian1,2WANGMei-Ling1,2FUShan-liang1,2DAIHua1ZHANGFan2,4

(1.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China; 2.HunanAcademyofScienceandTechnologyforInspectionandQuarantine,Changsha,Hunan410004,China; 3.DonggangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Donggang,Liaoning118300,China;
4.ChangshaEnvironmentalProtectionCollege,Changsha,Hunan410004,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.009

湖南省科技计划项目(编号：2015JC328)；粮油深加工与品质控制湖南省2011协同创新项目资助(编号：湘教通[2013]448号)

颜鸿飞，男，湖南出入境检验检疫局高级工程师，硕士。

张帆(1985—)，女，长沙环境保护职业技术学院副教授，博士。E-mail：amily9281@163.com

2017—05—08