慢性丙型肝炎患者中医证型与白细胞介素-28B基因多态性的关系*

赵友云 董瑞银 李 波 刘 玲 韩竖霞 陶军秀 王业富 孙莉军

1.湖北省中医院检验科 (湖北 武汉, 430061) 2.武汉大学病毒学国家重点实验室 3.武汉百泰基因工程有限公司 4.湖北省中医院肝病研究所 5.湖北省临床检验中心

·临床论著·

慢性丙型肝炎患者中医证型与白细胞介素-28B基因多态性的关系*

赵友云1,2董瑞银3李 波1刘 玲1韩竖霞1陶军秀4王业富2孙莉军5△

1.湖北省中医院检验科 (湖北 武汉, 430061) 2.武汉大学病毒学国家重点实验室 3.武汉百泰基因工程有限公司 4.湖北省中医院肝病研究所 5.湖北省临床检验中心

目的：研究CHC患者中医证型与白细胞介素28B(IL-28B) 单核苷酸多态性(SNP)的关系，探讨中医证候的分子学机理。方法通过回顾性研究，收集245例住院CHC患者的一般临床资料、中医证型和肝功能指标(ALT、AST、GGT、DBil、TBil、ALP和Alb)、HCV RNA含量，采用DNA测序技术检测CHC患者IL28B SNPs(rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728)基因型，并与235例健康对照组比较。用SPSS 20.0 软件分析各数据与中医证型的相关性。结果245例CHC患者中医证型分布规律为肝郁脾虚证最多(177例，72.2%)，其余证型分别为瘀血阻络证(38例，15.5%)、肝肾阴虚证(22例，9.0%)、肝胆湿热证(7例，2.9%)和脾肾阳虚证(1例，0.4%)；肝郁脾虚证患者在年龄、AST、DBil、TBil、ALP和HCV RNA含量与其他证型比较，差异有显著性意义(P<0.01)，且多见于年轻的、肝功能损伤程度较轻和HCV RNA含量较低的患者；肝郁脾虚证CHC患者的rs12980275 AA基因型和rs8099917 TT基因型和rsl2979860 CC基因型均显著高于其他证型(P<0.05,P<0.01)，IL-28B 5NP与健康对照组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。结论CHC患者中医证型以肝郁脾虚证最多；年龄和肝功能某些指标在不同中医证型之间存在差异，CHC患者中医证型与IL-28B基因某些位点的多态性相关，值得深入研究。

肝炎，慢性，丙型; 中医证型; IL-28B; 单核苷酸多态性

AbstractObjective: To investigate the relationship between syndrome types of traditional Chinese medicine (TCM) and IL28B gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis C.Methods: A total of 245 patients were enrolled retrospectively.The general characteristics, TCM syndromes, data of liver function (ALT, AST, GGT, DBIL, TBIL, ALP, and ALB) and HCV RNA were collected. IL28B single nuclear polymorphisms (SNPs) (rs12980275, rsl2979860, rs8099917, and rs10853728) of all patients and 235 health control were detected by DNA sequencing. The correlations between TCM syndromes and data were analyzed using the SPSS 20.0.Results:Among 245 patients in the study, the pattern of liver-depression and spleen-deficiency was maximum (177 cases, 72.2%), the rest of patients were obstruction of collaterals by blood stasis type (38 cases, 15.5%), yin deficiency of liver and kidney type (22 cases, 9.0%), damp-heat blocking in liver and gallbladder (7 cases, 2.9%) and yang deficiency of spleen and kidney (1 case, 0.4%) respectively. For age, AST, DBIL, TBIL, ALP and HCV RNA, the difference were significant between liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P<0.01). The majority patients of liver-depression and spleen-deficiency type were younger, milder liver damage, and lower load of HCV RNA. There was no statistical difference in the IL28B SNP between the patients of liver-depression and spleen-deficiency type and health group (P>0.05). Rs12980275 genotype AA and rs8099917 TT in the patients of liver-depression and spleen-deficiency type were significantly higher than that in other TCM syndromes (P<0.01), while for rsl2979860 genotype CC, there was no statistical difference in two groups (P>0.05).Conclusion:There were some relationship between TCM symptoms and objective indexes such as age, biochemical markers of liver and IL28B SNP in patients with CHC, which were worth further study.

KeyWordschronic hepatitis C; traditional Chinese medicine syndrome; IL28B; SNP

慢性丙型肝炎(CHC)是造成肝硬化及肝癌的重要原因之一[1]，聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林是治疗CHC的主要抗病毒方案,但仍然存在有持续病毒学应答率(SVR)偏低、副作用大、病毒反弹和经济负担偏重的影响因素[2,3]。中医以整体观和辨证施治的方式治疗CHC，在消除患者症状、改善肝脏功能、抑制病毒复制、提高生存率等方面效果显著[4]。

中医证型是中医认识疾病、诊断疾病，据此遣方治疗和观察疗效的关键。然而目前临床的中医辨证分型主要依据四诊结果分析和综合判断，存在一定的主观性和随意性。为寻找准确可靠、可重复的分子学标志物以揭示中医证型的内涵，我们采用DNA测序技术对CHC患者白细胞介素-28B(IL-28B) 4个位点(rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728)进行了单核苷酸多态性(SNP)分型检测，分析CHC患者中医证型与患者基本情况、肝脏功能、HCV RNA含量和IL-28B SNP的相关性。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 245例为2015年1月至2016 年6月在湖北省中医院住院的CHC患者，男123例，年龄20～80岁，平均56.73岁；女122例，年龄26～75岁，平均57.17岁；235例为此期间体检健康人员，为对照组，其性别和年龄与CHC患者比较，差异无显著性意义。

1.2 诊断标准 CHC诊断标准参考《丙型肝炎防治指南》[5]；中医证型(肝胆温热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、淤血阻络证和脾肾阳虚证)的诊断参考《病毒性肝炎中医辨证标准》[6]，由两位主治医师共同判断，并由一位主任医师审核确定。

1.3 纳入标准 符合上述CHC的诊断标准且符合中医证型之一者；年龄在12～80岁者；签署知情同意书。

1.4 排除标准 合并HIV 和( 或) 其他嗜肝病毒感染者；伴有心、肾、肺、内分泌、血液、代谢及胃肠道严重原发病者；不能合作者、或精神病患者；哺乳、妊娠或正准备妊娠的妇女。1.5 常规检测指标 采用罗氏module P800全自动生化分析仪检测ALT、AST、GGT、ALP、DBil、TBil和Alb；采用ABI Dx全自动荧光定量PCR仪检测HCV RNA。

1.6 人类基因组DNA提取及IL-28B基因分型 取患者外周EDTA(乙二胺四乙酸二钠)抗凝血500ul，采用离心柱方法(北京天根，中国)提取全基因组DNA，按照说明书进行操作。采用紫外分光光度仪(Eppendorf公司，德国)检测DNA浓度。运用PCR的方法对全基因组关联分析(GWAS)研究的候选基因位点rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728扩增后用3730测序仪测序并分型(上海生工生物工程有限公司)。PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性35s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。4个位点的引物设计应用PubMed Primer blast设计，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间差异采用t检验分析。计数资料如基因型和等位基因型分布差异，采用卡方检验分析。所有统计分析采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHC患者中医证型的分布规律 见表2。

2.2 肝郁脾虚证与其他4证患者基本情况 见表3。

表3 肝郁脾虚证与其他4证患者基本情况比较

表4 IL-28SNP在3组人员中检测结果比较 [n(%)]

a为肝胆湿热证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证和脾肾阳虚证中任一证型；b肝郁脾虚组与健康对照组比较；c为其他证型组与健康对照组比较；d为肝郁脾虚组与其他证型组比较

表3显示,肝郁脾虚证与其他证型相比，在年龄、AST、DBil、TBil、HCV RNA、ALP方面比较，差异有显著性意义(P<0.05,orP<0.01,orP<0.001)，而性别、ALT、GGT和Alb方面比较差异无显著性意义(P>0.05)

2.3 肝郁脾虚证和其他证型患者健康对照人员IL-28B SNPs基因型检测情况 见表4。

由表4可见，rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728的基因型和等位基因在肝郁脾虚组与健康对照组比较，差异无显著性意义(P>0.05)；其他证型组与健康对照组相比，rs12980275 AA基因型和A等位基因、rsl2979860 CC基因型和C等位基因、rs8099917 TT基因型和T等位基因的比率差异有显著性意义(P<0.01)，rs10853728 CC基因型和C等位基因的比率差异无显著性意义(P>0.05)；肝郁脾虚患者的rs12980275 AA基因型和A等位基因、rs8099917 TT基因型和T等位基因的比率显著高于其他证型组(P<0.01)，rsl2979860 CC基因型的检出率高于其他证型组，有显著性意义(P<0.05)，而rsl2979860的C等位基因虽高于其他证型组，但差异无显著性意义(P>0.05)。

3 讨论

本研究中245例CHC患者中医证型分布规律与陈建杰等报道[7]的不一致[气虚邪恋型(42.5%)、肝郁脾虚型(22.8%)、湿热中阻型(10.9%)、脾肾阳虚型(9.9%)、肝肾亏虚型(7.9%)、瘀血阻络型(6.0%)]，原因在于陈教授的研究，是按照多中心、大样本、广覆盖点的调查方式，对全国10个省18研究中心的1241例CHC患者的中医证型进行的流行病学调查。本研究所选患者仅为本院的住院患者，均为有症状者，且存在地区差异。

为探索中医证型的微观变化，胡志军等[8]分析了CHC患者各个证型的肝功能(ALT、AST、Alb)和HCV RNA等微观指标，发现CHC患者中医证型与肝功能异常、HCV RNA含量关系密切。本研究结果显示CHC肝郁脾虚证患者的年龄、AST、DBil、TBil和HCV RNA含量均小于或低于其他证型，提示CHC中医证型间存在肝脏功能指标和病毒载量的差异。

中医学认为HCV的感染多由湿热疫毒所致，然湿热疫毒进入人体后，其转归和结局差别很大，正气虚弱者造成发病且缠绵难愈；而脾胃功能健旺者，则外邪不另侵入，即使侵入亦或不发病，或发病后呈良性转归。可见，湿热毒邪侵入人体后发展为慢性肝炎或更严重的肝硬化、肝癌，实为人体正气已虚之故[9,10]，与机体免疫应答有关的观点相一致。王灵台[11]在研究CHC的中医证型中发现丙型肝炎是进展型疾病，早期为湿热雍盛，中期见肝郁脾虚，最终累及肾、络，可呈肾虚血瘀。我们的研究显示CHC肝郁脾虚证患者rs12980275 A等位基因和rs8099917 T等位基因的频率高于其他4证，与健康者比较，差异无显著性意义。有研究表明[12]，肝郁脾虚证患者经疏肝健脾、凉血解毒、活血化瘀治疗后可恢复肝脏功能，实现抗HCV和HCV RNA 阴转，可能与肝郁脾虚证患者的IL28B基因型有关，近年来(GWAS研究)发现IL-28B 的基因多态性与HCV感染者的病毒自发清除和疗效应答高度相关[13]，由此推断rs12980275 A等位基因和rs8099917 T等位基因可能是不同中医证型的潜在标志物。

综上所述，我们在CHC中医证型的分子分型研究中，发现肝郁脾虚证最多，且多见于年轻、肝脏功能损伤较轻、病毒含量较低者，与健康人群的IL-28B基因型和等位基因频率比较，差异无显著性意义，但与其他证型比较，差异有显著性意义。鉴于其他证型的病例偏少，为避免统计偏移误差，未逐一比较分析。未来会加大其他证型病例的收集和分型研究，以探索中医证型的分子学机理。

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RelationshipbetweenSyndromeTypesofTraditionalChineseMedicineandIL28BGenePolymorphismsinpatientswithchronichepatitisC

ZHAOYou-yun1,2,DONGYin-rui3,LIBo1,SunLi-jun5△,etal. 1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine

(WuhanHubei,430061)China

，2016-11-16 编辑：黄育华)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.002

国家科技部重大专项(No.2012ZX10005004-003)，病毒学国家重点实验室开放基金项目(No.2015KF006)；△通讯作者