氮肥形态对李氏禾富集铜的影响及生理响应

张存款，林华*，满向甜，张学洪，陈俊

氮肥形态对李氏禾富集铜的影响及生理响应

张存款1,2，林华1,2*，满向甜1,2，张学洪1,2，陈俊1,2

1. 桂林理工大学//广西环境污染控制理论与技术重点实验室，广西 桂林 541004；
2. 桂林理工大学//岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，广西 桂林 541004

土壤重金属污染是环境和生态领域研究的热点及难点。超富集植物受到土壤各种特性的影响，需要采取强化措施来提高植物修复效率。该文旨在加深对李氏禾（Leersia hexandra Swartz）累积铜的认知，为植物修复铜污染土壤提供理论数据。在土壤中铜污染水平分别为低（100 mg∙kg-1）、中（300 mg∙kg-1）、高（500 mg∙kg-1）时，研究不同氮肥(NH4)2SO4、CO(NH2)2、Ca(NO3)2、NH4NO3处理对超富集植物李氏禾累积铜、植物生长的影响以及生理响应，氮肥按肥土质量比 0.3‰以水溶液的形式每周添加1次，李氏禾生长两个月后，收获，进行植株分析。结果表明：在土壤铜污染水平为500 mg∙kg-1时，施加Ca(NO3)2后李氏禾根、茎、叶中的铜富集量达到最大，分别为6167.15、1251.99和975.92 mg∙kg-1，约为对照处理组的2.5～4.0倍，相对于其他各氮肥处理和对照组差异达显著。在低、中、高 Cu污染水平下，施加(NH4)2SO4处理组李氏禾株高均显著高于其他处理组，分别为68.5、65.2和65 cm；CO(NH2)2组李氏禾生物量分别为12.75、13.45和11.63 g∙10 plants-1；叶绿素质量浓度分别为24.139、22.615、23.752 mg∙L-1；可溶性蛋白质量分数分别为21.704、23.506和20.940 mg∙g-1；金属硫蛋白质量分数分别为9131.06、10014.02和11018.04 pg∙g-1，均高于其他处理组；而NH4NO3处理组李氏禾叶片中丙二醛（MDA）物质的量浓度最少，分别为0.893、0.957和0.859 μmol∙L-1，有效地缓解了铜对李氏禾的损伤。因此，适量施加氮肥可以有效提高李氏禾的生物量以及根、茎、叶各部分铜累积量，增强了李氏禾对铜污染土壤的修复效果。

铜；李氏禾；生理响应；氮肥形态

李氏禾（Leersia hexandra Swartz）广泛地分布于中国南部（张学洪等，2006），是在中国境内首次被发现的湿生铬超富集植物，具有繁殖快、单位面积生物量大以及可以高密度的生长的特点，适合在水生和潮湿的环境下生长，为重金属污染水体和土壤的植物修复提供了宝贵的资源（张学洪等，2008；陶笈汛等，2010）。试验发现李氏禾对于铜同样具有超富集吸附效果（张学洪等，2005；陈俊等，2008）。施肥是农艺活动中提高土地肥力和作物产量的重要措施（Wu et al.，2004；沈丽波等，2010）。Fayiga et al.（2008）研究发现，施肥同样是提高超积累植物修复污染土壤效率的重要辅助方法。施加氮肥可以改变重金属在土壤中的形态和活性，适量施肥可以显著提高植物的生物量，避免生物稀释效应，从而增加植物体内的重金属累积总量（王林等，2008；Xie et al.，2009）。本研究通过施加不同形态的氮肥，探讨其对李氏禾铜累积可能产生的影响，旨在为氮肥辅助李氏禾富集重金属，修复污染土壤的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试植物与土壤

供试李氏禾采自桂林市雁山镇的田埂边，未受到污染。土壤采自桂林市雁山镇雁园附近的水稻田，土壤基本理化性质：有机质0.83%，阳离子交换量 12.1 cmol∙kg-1，速效钾 96.4 mg∙kg-1，碱解氮150 mg∙kg-1，速效磷 9.3 mg∙kg-1，pH 6.4。

1.2 试验设计

在温室条件下进行土培盆栽试验，选取长势一致的李氏禾幼苗移栽到供试试验盆中稳定1周，土壤底肥磷和钾分别以KH2PO4和K2SO4形式施入，K和P施用量均为0.13 g∙kg-1，氮肥的施入形态分别为(NH4)2SO4、CO(NH2)2、Ca(NO3)2、NH4NO3，氮肥按肥土质量比 0.3‰以水溶液的形式每周施加1次，并设不添加氮肥作为对照组。土壤铜含量按照低污染水平（L，100 mg∙kg-1），中污染水平（M，300 mg∙kg-1）和高污染水平（H，500 mg∙kg-1）添加，混匀后温室条件下稳定2周后，定量称取2.5 kg土装入备好的塑料盆中，每盆移栽20～30株李氏禾，每个处理设有3个平行，李氏禾生长过程中使用自来水浇灌，盆栽土壤保持含水量 50%～60%，生长60 d后，收获李氏禾并进行植株分析。

1.3 研究方法

将李氏禾样品从盆中连根移出，清理掉附着在根系表面的土壤，使用自来水冲洗干净，再用 0.1 mol∙L-1的Ca(NO3)2溶液浸泡30 min洗去表面的重金属，然后用去离子水冲洗3次，最后用吸水纸把表面水吸干，将李氏禾分开为根、茎、叶三部分。于105 ℃烘箱中杀青30 min，80 ℃烘干至恒重，粉碎备用。采用HNO3-HClO4湿法消解，用ICP-OES测定李氏禾根、茎、叶中铜含量。

生理响应：测定叶绿素（Cho et al.，1999）和蛋白质（福林-酚试剂法）含量；测定李氏禾植株体内丙二醛（硫代巴比妥酸比色法；王晓维等，2014）和金属硫蛋白（MT，酶联免疫法）。

采用 SPSS 18.0软件中的单因素方差分析（ANOVA）对数据进行统计分析，采用最小显著差数法（LSD）对数据进行显著性检验（p＜0.05）。运用Origin 9.0进行作图。

2 结果与数据分析

2.1 不同氮肥形态对李氏禾株高和生物量的影响

株高和生物量是反映植物对重金属耐性的重要指标。与对照组相比，各氮肥处理对李氏禾的株高（图1）和生物量（图2）均有显著的作用。低、中、高铜污染水平土壤均以(NH4)2SO4处理组的李氏禾株高和CO(NH2)2处理组李氏禾的生物量最大，分别达到了68.5、65.2和65 cm，12.75、13.45和11.63 g∙10 plants-1。高、中和低铜污染水平间株高和生物量差异均不显著。但随土壤重金属污染水平的增加，李氏禾的株高和生物量都呈下降趋势，说明李氏禾的生长受到重金属毒害的影响。

与对照组相比，施用氮肥的李氏禾株高均存在显著性差异（P＜0.05），而(NH4)2SO4和 CO(NH2)2之间、Ca(NO3)2和NH4NO3之间的株高差异性不显著（P＞0.05），其余氮肥组之间均存在显著性差异（P＜0.05）。各氮肥处理组的生物量相对于对照显著（P＜0.05），且各组间的差异性均达到显著水平，其中(NH4)2SO4、Ca(NO3)2和NH4NO3处理组间的生物量差异性达到极显著水平（P＜0.01）。

图1 不同氮肥处理李氏禾的株高Fig. 1 Plant height of L. hexandra with different nitrogen treatment

图2 不同氮肥处理李氏禾的生物量Fig. 2 Biomass of L. hexandra with different nitrogen treatment

2.2 不同氮肥形态对李氏禾富集铜的影响

李氏禾收获后，测定其根、茎、叶的重金属含量，分别如图3、图4、图5所示。施用Ca(NO3)2处理的李氏禾对重金属铜的富集最高，在土壤铜污染水平为500 mg∙kg-1时，李氏禾根、茎、叶中铜质量分数分别为 6167、1252、976 mg∙kg-1。Ca(NO3)2组李氏禾地下和地上部分铜富集量均高于对照和其他氮肥组，且差异性显著（P＜0.05）。

从图3、图4、图5可进一步看出，无论土壤施用何种形式的氮肥，李氏禾根吸铜量远远高于地上部吸铜量，表明在该试验条件下，李氏禾均可吸收铜并将其储存于根部。随着金属铜污染水平的增大，李氏禾吸附铜的转运系数呈下降趋势（表1），说明金属浓度影响了金属铜由地下向地上部分的转运，因为植物修复主要通过收割地上部实现，所以氮肥形态如何促进重金属Cu向李氏禾的地上部分转运需进一步研究。

图3 不同氮肥处理李氏禾根部Cu含量Fig. 3 Cu concentration in root of L. hexandra with different nitrogen treatment

图4 不同氮肥处理李氏禾茎部Cu含量Fig. 4 Cu concentration in stem of L. hexandra with different nitrogen treatment

2.3 不同氮肥形态对李氏禾富集铜的生理响应

收获后，测定李氏禾叶绿素、丙二醛（MDA）、蛋白质以及金属硫蛋白，结果分别如图 6、图 7、图8和图9所示。

图5 不同氮肥处理李氏禾叶部Cu含量Fig. 5 Cu concentration in leaf of L. hexandra with different nitrogen treatment

图6 不同氮肥处理李氏禾叶片叶绿素的含量Fig. 6 The content of chlorophyll in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如图6所示，施用CO(NH2)2组李氏禾叶绿素含量在所有处理组中最高。这是因为氮是叶绿素的重要组成元素，CO(NH2)2中氮含量最高，更加有利于李氏禾进行光合作用以及合成叶绿素。在低、中、高Cu污染水平下，相对于对照组，CO(NH2)2组李氏禾叶绿素含量分别提高了 104.69%、85.73%和72.03%；相对于 Ca(NO3)2组，CO(NH2)2组李氏禾叶绿素含量分别提高了37.28%、28.15%和34.53%，且与其他各组的差异性达到极显著水平（P＜0.01），这一点与李氏禾的生物量类似。Ca(NO3)2中氮含量最少，相应的叶绿素含量也最少，且与其他氮肥组差异达显著水平（P＜0.05）。氮肥对李氏禾叶绿素的作用效果为：Ca(NO3)2＞(NH4)2SO4＞ CO(NH2)2＞NH4NO3。

如图7所示，对照组李氏禾细胞受到的损伤更大，与其他各氮肥组相比差异达极显著水平（P＜0.01）；NH4NO3处理组李氏禾受到的损伤最小，在低、中、高Cu污染水平下，与对照组相比，李氏禾丙二醛含量分别降低了 41.94%、39.75%和47.50%，有效缓解了重金属铜对李氏禾的损伤。3种污染水平下，(NH4)2SO4处理组李氏禾丙二醛含量相对于对照组分别降低了 19.23%、13.89%和18.37%，CO(NH2)2、Ca(NO3)2处理后，虽然一定程度缓解了铜对李氏禾的毒害，但效果有限，介于NH4NO3和(NH4)2SO4之间。

表1 不同氮肥处理李氏禾转运系数Table 1 Translocation factors of L. hexandra with different nitrogen treatment

图7 不同氮肥处理李氏禾叶片中的丙二醛Fig. 7 The content of MDA in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

图9 不同氮肥处理李氏禾叶中的金属硫蛋白Fig. 9 The content of MT in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如图8所示，各氮肥处理组可溶性蛋白质含量均与对照组存在极显著差异（P＜0.01），CO(NH2)2组李氏禾蛋白质含量在所有处理组中最高，和叶绿素的研究结果类似。在低、中、高Cu污染水平下，相对于对照组，李氏禾蛋白质含量分别提高了 56.07%、68.14%和49.79%；而(NH4)2SO4处理组李氏禾可溶性蛋白的促进作用最小，相对于空白对照组，分别提高了29.11%、33.92%和16.26%。Ca(NO3)2与NH4NO3处理组效果则处于以上两者之间，且随着铜污染水平的增加，均出现了先升后降的变化趋势。

图8 不同氮肥处理李氏禾叶中的蛋白质Fig. 8 The content of protein in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如图9所示，各氮肥处理组金属硫蛋白含量均与对照组存在显著性差异（P＜0.05），CO(NH2)2组李氏禾金属硫蛋白含量在所有处理组中最高。在低、中、高Cu污染水平下，相对于对照组，CO(NH2)2组李氏禾金属硫蛋白含量分别提高了 32.19%、34.52%和42.53%，和蛋白质、叶绿素的研究结果类似；NH4NO3处理组李氏禾金属硫蛋白相对于对照组分别提高了9.00%、13.46%和15.78%，但随着重金属铜污染水平增加，李氏禾所含的金属硫蛋白的含量也呈增加趋势。

3 讨论

与对照组相比，氮肥处理李氏禾株高均存在显著性差异，(NH4)2SO4处理组李氏禾株高和CO(NH2)2处理组李氏禾生物量最大。随着土壤 Cu污染水平增加，李氏禾株高和生物量都呈下降趋势，说明李氏禾的生长受到重金属毒害的影响。几种氮肥相比，尿素 CO(NH2)2的含氮量最高（46.67%），最有利于光合作用，故生物量也最大。而硫酸铵中除含有氮外，还含有25%硫，而硫作为一种重要的肥料，可能也是导致李氏禾株高大于其他各组的原因。李莲芳等（2013）发现了不同形态氮肥的施用均显著促进了小白菜（Brassica chinensis）植株的生长，增幅为104.5%～ 224.3%。

氮肥加入土壤后改变了土壤 pH，土壤吸附的重金属发生解吸，易于植物对重金属的吸收。添加氮肥后，植物在吸收 NH4+和 NO3-的同时，根系会分泌 H+和 OH-，致使李氏禾根系周围呈酸性或碱性。(NH4)2SO4造成根际土壤酸化，施用 Ca(NO3)2造成根际土壤碱化，NH4NO3使根际土壤保持中性，而 CO(NH2)2水溶液呈弱碱性。Ca(NO3)2处理促进李氏禾从土壤中吸收更多的活性铜，而钙是构成细胞壁的重要元素，它与蛋白质分子相结合，是质膜的重要组成成分，田静等（2014）发现李氏禾对Cu的吸收与钙离子通道密切相关。(NH4)2SO4处理抑制了李氏禾从土壤中吸收活性铜，CO(NH2)2和NH4NO3处理组李氏禾吸附的铜则处于以上两者中间，这跟 Zhang et al.（2009）和 Wang et al.（2004）的研究结果基本一致。施用氮肥对土壤中铜含量的降低有显著影响，提高了东方山羊豆（Galega orientalis）的铜累积量（Symanowicz et al.，2015）。李氏禾根系对铜的吸收依靠主动运输机制，ATP酶抑制剂和低温处理均能显著地抑制李氏禾根系对铜的吸收（田静等，2014）。施肥、植物激素以及螯合剂，都对植物生长发育及其对土壤中重金属的吸收具有显著影响（周建民等，2007；卫泽斌等，2015；王平等，2013）。同样，IAA和EDTA处理能够促进李氏禾生长发育，有效缓解土壤Cu对李氏禾的胁迫作用，并显著增加了李氏禾地上部分Cu的含量（梁亮，2016）。本试验中所施加的各种氮肥对于李氏禾富 集 铜 的 促 进 效 果 为 ： Ca(NO3)2＞(NH4)2SO4＞CO(NH2)2＞NH4NO3。

重金属对植物光合作用的抑制机理是重金属阻碍光合电子的传递，抑制质体醌和类胡萝卜素的合成，同时重金属引起植物叶片气孔关闭导致CO2浓度不足。植物进行光合作用后会释放氧气，而这一反应过程被认为是过氧化物的一个重要来源，因此研究叶绿体对抗氧化胁迫的响应，同样是研究李氏禾在重金属铜胁迫下的生理响应。王平荣等（2009）认为，氮和镁作为叶绿素组成的重要成分，其缺少时会影响叶绿素的形成。叶片中叶绿素含量的高低直接关系着光合作用的强弱，同时植物的生长和生物量的增加都有赖于植物的光合作用。Ca(NO3)2中氮含量最少，相应的叶绿素含量也最少，但是其铜富集量最大，可能是因为Cu胁迫抑制了李氏禾对氮的吸收，从而减少了叶绿素的合成。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤（刘俊祥等，2015；王晓维等，2014），丙二醛（MDA）含量的升高可能与植物组织中ROS的大量积累有关，ROS含量的增加不仅威胁植物的生长发育，同时还能增强脂质过氧化作用。植物体中MDA含量越高，表明脂质过氧化作用程度越激烈，对细胞的损伤就越大。张杏锋等（2017）发现随着金属浓度的增高，膜脂过氧化作用加剧，对植物造成的伤害程度增大。说明脂质过氧化作用在高浓度Cu胁迫下变得激烈，对李氏禾细胞造成了巨大的损伤。施加氮肥不仅提高了李氏禾对金属铜的耐受性，增强其Cu富集能力，同样缓解了李氏禾叶片的损伤，这一点与李氏禾的株高和生物量表现类似。

可溶性蛋白质是植物体重要的生理生化指标，是细胞中最重要的含氮大分子之一，其含量是了解植物体中总代谢的重要指标，也可以用来衡量是否发生重金属胁迫。氮素对植物生长发育的影响是十分明显的。当氮素充足时，植物可合成较多的蛋白质，可促进细胞的分裂和增长，因此植物叶面积增长快，更有利于光合作用。随着金属铜污染水平增加，可溶性蛋白质含量出现了先升高后下降的变化，中浓度Cu可引起可溶性蛋白质含量应激性升高，高浓度时下降，主要是由于Cu胁迫时间过长，植株体受到损害（关梦茜等2014）。Cu诱导植物体内活性氧的大量积累，而后进一步破坏蛋白质的氨基酸残基，引起大量蛋白质的功能丧失。而氮肥处理组李氏禾叶片中可溶性蛋白质均超过对照组，可能与光合效率的提高存在协同作用。

金属硫蛋白（MT）是分子量较低且富含半胱氨酸的一类蛋白质，能结合多种金属，在植物对重金属的解毒机制中有着重要的作用。MT的作用形式通常与其清除ROS的能力有关，MT还能通过巯基与金属离子结合，改变生物体内重金属的活性，从而降低重金属离子的毒性。MT的过度表达通常能提高植物对重金属的耐受性，在Yang et al.（2009）和Sekhar et al.（2011）的研究中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）植物通过CcMT1的过度表达来增强植物对Cu和Cd的耐受性。叶片中产生的MT在抵御Cu胁迫中起着重要的保护作用，不同氮肥对李氏禾的MT含量的促进效果不同，可能跟其诱导MT的表达反应有关，MT含量的增加，提高了李氏禾对铜的耐性。

4 结论

施用不同氮肥能明显提高Cu污染土壤上生长的李氏禾生物量，其中以施用 CO(NH2)2的效果最为明显。氮肥的施用对李氏禾吸附铜有促进作用，施用 Ca(NO3)2的植株地上部和根吸收铜量均高于施用其他3种氮肥。叶绿素和蛋白质的合成都离不开氮，氮素供应充足，能保证叶绿素和蛋白质的合成，所以4种氮肥处理中李氏禾叶绿素、蛋白质以及金属硫蛋白含量均高于对照。在500 mg∙kg-1铜处理土壤上生长的李氏禾金属硫蛋白含量高于 100 mg∙kg-1和 300 mg∙kg-1处理组，可能是金属硫蛋白的增加有助于植物解毒机制的加强。

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Abstract: Heavy metal pollution in soil has become the research hotspot. The performance of hyperaccumulator was affected by various soil properties. The primary objective of this work is to improve understanding of the impacts of Cu-accumulation in Leersia hexandra Swartz and to provide theoretical data for phytoremediation of Cu-polluted soils. This study analyzed the Cu-accumulation in L. hexandra, the plant growth and its physiological responses under different Cu pollution level (low: 100 mg∙kg-1; Medium: 300 mg∙kg-1; high: 500 mg∙kg-1) for two months, applied (NH4)2SO4, CO(NH2)2, Ca(NO3)2and NH4NO3nitrogen fertilizer, respectively.According to the mass ratio of 0.3‰, soil nitrogen in the form of aqueous solution was added 1 time a week. The result indicated that when the Cu pollution level was 500 mg∙kg-1, the highest mean levels of Cu-accumulation (roots: 6167.15 mg·kg-1; stem: 1251.99;leaf: 975.92 mg·kg-1) were detected in Ca(NO3)2treatment, which had significant difference from other nitrogen treatment group and control group (Cu-accumulation was 2.4～4.0 times as the control group). However, under each Cu pollution level (low, medium,high), NH4NO3treatment had the tallest plant height (68.5, 65.2 and 65 cm, respectively). CO(NH2)2treatment present higher data than other groups on the biomass (12.75, 13.45 and 11.63 g∙10 plants-1, respectively), the chlorophyll content (24.139, 22.615 and 23.752 mg∙L-1, respectively), soluble protein content (21.704, 23.506 and 20.940 mg∙g-1, respectively) and the content of metallothionein (9131.06, 10014.02 and 11018.04 pg∙g-1, respectively). The content of MDA reached the lowest in NH4NO3treatment which relieved effectively the damage on the plant cause by the copper. In summary, the biomass and Cu-accumulation of L.Hexandra can be effectively enhance by appropriate amount of nitrogen fertilizer application which improved its remediation effect in Cu-polluted soils.

Key words: Cu; Leersia hexandra Swartz; physiological response; nitrogen fertilizer morphology

Effect of Nitrogen Forms on Cu Uptake by the Leersia Hexandra Swartz and Physiological Response

ZHANG Cunkuan1,2, LIN Hua1,2*, MAN Xiangtian1,2, ZHANG Xuehong1,2, CHEN Jun1,2

1. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China;2. Guangxi Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area，Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.09.020

X173

A

1674-5906（2017）09-1599-06

张存款, 林华, 满向甜, 张学洪, 陈俊. 2017. 氮肥形态对李氏禾富集铜的影响及生理响应[J]. 生态环境学报, 26(9):1599-1604.

ZHANG Cunkuan, LIN Hua, MAN Xiangtian, ZHANG Xuehong, CHEN Jun. 2017. Effect of nitrogen forms on Cu uptake by the Leersia Hexandra Swartz and physiological response [J]. Ecology and Environmental Sciences, 26(9): 1599-1604.

国家自然科学基金项目（41361085）

张存款（1990年生），男，硕士研究生，主要研究方向为水处理技术。E-mail: 1536696557@qq.com

*通信作者：林华（1984年生），男，博士研究生，主要研究方向为重金属污染及恢复生态学。E-mail: linhua5894@163.com

2017-07-13