外源酶对六堡茶渥堆过程中色素转化规律影响

张芬，温立香，黄欣欣，彭靖茹，何梅珍，林家威，黄寿辉，檀业维，黄俊达

（1．广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁530001；2．广西壮族自治区梧州茶厂，广西 梧州543002）

外源酶对六堡茶渥堆过程中色素转化规律影响

张芬1，温立香1，黄欣欣1，彭靖茹1，何梅珍2，林家威2，黄寿辉1，檀业维1，黄俊达2

（1．广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁530001；2．广西壮族自治区梧州茶厂，广西 梧州543002）

通过在六堡茶渥堆过程添加纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶及过氧化物酶，研究外源酶对干茶色泽变化和茶叶中茶黄素、茶红素及茶褐素转化规律的影响及其与茶多酚含量的相关性，旨在为缩短六堡茶的渥堆时间和提高六堡茶的品质提供理论依据。结果表明：果胶酶在六堡茶渥堆的前期可以显著提高茶黄素含量及促进茶汤色泽的加深，而渥堆的后期能够提高茶红素和茶褐素的含量，第10天时，茶黄素含量是空白样的2.23倍，第20天时茶红素含量是空白样的4.32倍，渥堆结束时茶褐素含量比空白样提高29.66%；木瓜蛋白酶在渥堆15天后能迅速增加茶褐素的含量及促进干茶色泽的加深；过氧化物酶在渥堆前期可以显著提高茶褐素的含量，在渥堆的中期提高茶黄素含量的效果较明显，第15天时，茶黄素含量提高64.29%；纤维素酶能够降低茶红素转化成其他物质的速度。此外，茶红素含量与茶多酚含量呈正相关的线性关系，而茶褐素含量与茶多酚含量呈指数函数关系。因此，果胶酶、过氧化物酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶对六堡茶渥堆过程中色素的转化影响明显。

六堡茶；渥堆；外源酶；茶叶色素

Abstract：The paper studied on the effect of exogenous enzymes on the change of color of dry tea，tea pigments and their relevance to the content of tea polyhenol by adding cellulase，pectinase，papain and peroxidase during pile-fermentation processing of Liu Pao tea，providing a theoretical basis for reducing time of pile-fermentation and improving the quality of Liu Pao tea.The result indicated that pectinase could increase the content of theaflavins（TF）and deepen the color of tea soup in pre-pile-fermentation，and it could increase the contents of thearubigins（TR）and theabrownin（TB）in post-pile-fermentation.At the 10th d of pile-fermentation，the content of theaflavins（TF）was 2.23 times than blank sample，the content of thearubigins（TR）increased was 4.32 times than blank sample in post-pile-fermentation，the content of theabrownin（TB）increased by 29.66%at end of pile-fermentation.Papain could rapidly increase the content of theabrownin（TB）after the 15th d of pile-fermentation and deepen the color of dry tea.Peroxidase could obviously increase the content of theabrownin（TB）in pre-pile-fermentation and the content of theaflavins（TF）in the medium pile-fermentation，at 15th d of pile-fermentation，the content of theaflavins （TF）increased by 64.29%.Cellulase could reduce the speed of thearubigins（TR）converted into other substances.Besides，the contents of thearubigins（TR）and tea polyphenol had a linear function，the contents of theabrownin （TB）and tea polyphenol had a exponential relationship.So the effects of pectinase，papain，peroxidase and cellulase on change of tea pigments were significantly during pile-fermentation processing of Liu Pao tea.

Key words：Liu Pao tea；pile-fermentation；exogenous enzymes；tea pigments

六堡茶因产自于梧州苍梧县六堡镇而得名，以其独特的槟郎香而位列全国二十四名茶[1]，其采用广西地方性的群体种茶树鲜叶，经独特的传统工艺加工而成，其中渥堆工序是制作六堡茶的关键工艺[2]。黑茶渥堆是利）用微生物活动产热而形成的湿热作用及其分泌胞外酶的催化作用，形成黑茶特有的色香味[3-7]。其中多酚类物质通过酶促氧化及自动氧化形成水溶性色素和部分脂溶性色素，水溶性色素包括茶黄素（TF）、茶红素（TR）和茶褐素（TB），而这 3种色素是形成黑茶汤色的主要成分[8]。

外源酶指不属于制品本身所固有的外加酶类，主要从茶鲜叶、茶幼果及其他植物或其愈伤组织中提取得到，也有些是从培养的微生物中获得[9]，20世纪70年代酶工程技术开始应用于茶叶领域。目前，多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等多种外源酶已经应用于各类茶叶的加工过程中[10-14]，以达到增加茶叶香气、改善茶叶品质及缩短加工时间的目的。而六堡茶作为广西的历史名茶，其渥堆工艺仍然采用传统的加工方式，存在耗时长、劳动强度大、卫生条件差等亟需解决的问题[15]。目前，尚未有关于外源酶应用于六堡茶渥堆工艺的研究报道。本文通过在六堡茶渥堆过程中添加不同类型的外源酶，研究不同的外源酶对干茶色泽和茶黄素、茶红素、茶褐素在六堡茶渥堆过程中变化规律的影响以及这3种色素含量与茶多酚含量之间的关系，旨在为缩短六堡茶渥堆时间和改善六堡茶品质提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

黑毛茶采用云南大叶种鲜叶经初制加工而成；渥堆试验于2016年9月份在梧州茶厂进行。

过氧化物酶（100 U/mg）：湖北佳诺信生物化工有限公司；木瓜蛋白酶（200 U/mg）、纤维素酶（20 U/mg）、果胶酶（30 U/mg）：南宁庞博生物化工有限公司；福林酚、草酸、碳酸氢钠（均为分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；甲醇、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；乙腈（色谱纯）：国药试剂化学有限公司；没食子酸（GA纯度＞99%）：美国sigma公司。

1.2 仪器和设备

YF-6CHF-18茶叶发酵机：永锋茶叶机械有限公司；UV/V-1800型紫外/可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅：河南省金坛市医疗仪器厂；FW-100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SHZ-DШ循环水式真空泵：河南省巩义市予华仪器有限责任公司；CP-∏4电子天平（0.000 1 g）：上海奥豪斯仪器有限公司；Master-S15纯水仪：上海和泰仪器有限公司；TDL-40B型离心机：北京压力恩科学器材公司；CR-400色差仪：日本柯尼卡美能达公司。

1.3 方法

1.3.1 试验样品的制备

利用去离子水把纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、过氧化物酶分别配制成浓度为500、250、250、20 U/mL的溶液。按照液叶比为1∶10（g/mL）的比例将4种配制的酶液和空白去离子水分别喷洒在15 kg的黑毛茶上，混匀，装入竹篓中，每个试验重复3次。将发酵机的温度设置为35℃，湿度设置为80%，把竹篓放入发酵机内，保持茶叶含水量为20%～25%，每隔4天翻堆一次。发酵之日起第 0、5、10、15、20、25 天取样，自然晾干即为试验样品。

1.3.2 茶黄素、茶红素、茶褐素及茶多酚含量测定方法

茶多酚含量测定：参照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；茶黄素、茶红素和茶褐素含量测定：采用系统分析法[16]。每个样品测定3次。

1.3.3 干茶色度测定方法

把试验样品经粉碎机粉碎，过孔径为800 μm的筛子，用CR-400色差仪进行测定，每个试验样品测定3次。测定采用D65光源，在20℃的室温下测定；试验采用Hunter Lab色系统，此系统中，L是明度变量，a和b是色品坐标，a表示从洋红色至绿色的范围，b表示从黄色至蓝色的范围。L的值域为0～100，L=50时，就相当于50%的黑；a和b的值域都是+127至-128，其中+127a是红色，渐渐过渡到-128a的时候变成绿色；同理+127b代表黄色，-128b代表蓝色，所有的颜色都是由这3个值交互变化组成[17]。

1.4 统计分析

用SPSS 17.0软件进行数据分析与处理。

2 结果和分析

2.1 外源酶对六堡茶在渥堆过程中茶叶色素转化规律的影响

黑茶在渥堆过程中，在湿热作用以及微生物分泌的胞外酶的催化作用下，茶叶中酚类物质被氧化为极不稳定的邻醌，邻醌又形成黄烷醇类和次级氧化产物茶黄素等，随着渥堆的继续进行，这些物质进一步氧化生成茶红素及茶褐素，使茶汤的色泽逐步加深[18]。外源酶对六堡茶在渥堆过程中茶叶色素含量的变化影响见表1。

表1 外源酶对六堡茶在渥堆过程中茶色素含量变化的影响Table 1 The effect of exogenous enzymes on change of content of three pigments during pile-fermentation of Liu Pao tea

如表1所示，六堡茶在渥堆过程中，茶黄素累积较少，其含量在0.031%～0.086%的范围内，并且变化的规律不明显。整个渥堆过程中果胶酶提高茶黄素含量的效果优于其他酶类，特别是在第10天，其茶黄素含量是空白样2.23倍，过氧化物酶在渥堆第15天时，其茶黄素含量比空白样提高64.29%。茶红素的含量随着渥堆时间的增加而大幅度降低，由初始的2.272%降低到渥堆结束时的0.130%～0.270%，在渥堆第15天时过氧化物酶降低茶红素的效果最为明显，其茶红素含量比空白降低了60.78%；果胶酶和纤维素酶能够降低茶红素转化成其他物质的速度从而使其添加样中茶红素含量高于空白样，渥堆第20天时，添加果胶的样品中茶红素含量是空白样的4.32倍，添加纤维素的样品中茶红素含量是空白样的2.18倍；木瓜蛋白酶对茶红素含量变化规律的影响不明显。茶褐素在渥堆过程中呈现逐渐增加的趋势，其含量由开始时的0.901%增加到结束时的2.316%～3.082%，过氧化物酶在渥堆第5天时提高茶褐素含量的效果较为显著，其茶褐素的含量比空白样提高27.82%，而果胶酶和木瓜蛋白酶在15 d后能迅速增加茶褐素的含量，渥堆结束时茶褐素的含量比空白样分别提高29.66%和33.07%。

2.2 外源酶对茶汤色泽在六堡茶渥堆过程中变化的影响

研究表明水溶性色素茶黄素、茶红素和茶褐素是影响黑茶汤色的主要物质，茶黄素、茶红素和茶褐素分别是构成茶汤“亮”、“红”、“褐”的主要成分[19]。茶黄素和茶红素的含量的总和与茶褐素含量比值大小即（TF+TR）/TB值是影响茶汤色泽的主要因子，比值越小，汤色越深[20]。而茶汤色泽的深浅是判断黑茶渥堆程度的重要依据[21]。

六堡茶渥堆过程中添加外源酶对茶汤色泽变化的影响如图1所示。

图1 外源酶对六堡茶渥堆过程中茶汤色泽变化的影响Fig.1 The effect of exogenous enzyme to change of color of tea soup during pile-fermentation of Liu Pao tea

由图1可知，茶汤色泽随着渥堆时间的增加而逐渐加深，（TF+TR）/TB比值由开始的2.58减少到渥堆结束时的0.07～0.12，渥堆0 d～10 d内，茶汤色泽急剧加深，可见，六堡茶的渥堆过程中TB大量形成，对六堡茶的汤色红褐品质的形成有着至关重要的作用，随着渥堆时间的增加，（TF+TR）/TB比值趋向于一致。渥堆5 d后，添加果胶酶可以使（TF+TR）/TB比值增大，即果胶酶可以促进茶汤色泽的加深，特别是在第10天时，（TF+TR）/TB较空白样增大76.11%，其它酶类的作用不明显。

2.3 干茶色泽分析

利用色差仪对不同渥堆天数的干茶进行色泽测定，测定结果见表2。

表2 六堡茶在渥堆过程中干茶色泽变化规律Table 2 The change of colors of dry tea during pile-fermentation of Liu Pao tea

如表2所示，六堡茶在渥堆过程，L值总体上呈现先减小后增大再减小的趋势，即渥堆过程中干茶色泽上的明度变化方向并不是一成不变的，渥堆开始时L值最大，为56.04，结束时L值达到最小，为40.67～44.36，渥堆15 d～20 d，木瓜蛋白组比空白组的L值小，即添加木瓜蛋白酶可以促进干茶色泽的加深；a值在渥堆过程中逐渐增大，由开始时的-0.56增加到渥堆结束时的3.62～4.60，即在渥堆过程中干茶色泽由绿色向红色转变，添加外源酶可以减小干茶色泽由绿色向红色转变的速度，特别是添加过氧化物酶；b值在渥堆过程中先减小后增加再减小的趋势，渥堆10 d后，纤维素酶可以增大b值，而过氧化物酶、木瓜蛋白酶和果胶酶则可以减小b值。

2.4 茶红素和茶褐素含量与茶多酚含量的相关性研究

茶多酚是在茶汤中呈苦涩味且有较强的刺激性的活性物质，是影响茶汤滋味的重要物质[22]。黑茶渥堆过程中通过微生物活动产生的湿热作用及酶促作用下，茶多酚特别是呈现苦涩味的儿茶素经过氧化、转化、缩合等复杂的过程形成水溶性色素，而茶叶中水溶性色素主要指茶黄素、茶红素、茶褐素，这三者是构成茶汤色泽的主要成分，所以茶汤的色泽可以体现出多酚类物质的氧化程度，因而一般制茶做色程度的深浅是以多酚类化合物为依据的[23-27]。茶黄素、茶红素及茶褐素的含量应与茶多酚含量有密切的联系。

由于六堡茶渥堆过程中茶黄素含量比较稳定，与茶多酚含量的相关性不明显，本文暂不讨论。为了研究六堡茶渥堆过程中茶红素和茶褐素的含量与茶多酚含量的相关性，以茶多酚含量X为自变量，以茶叶色素含量Y为因变量进行线性回归分析，结果见表3。

表3 茶叶色素含量与茶多酚含量线性回归分析Table 3 The analyze of linear regression of content of tea pigments and tea polyphenol

如表3所示，茶红素的含量与茶多酚含量呈现线性关系，且正相关，即茶红素在六堡茶在渥堆过程中随着茶多酚含量的减少而减少。空白样及添加纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和过氧化物酶试验样线性关系系数 R2分别是 0.985、0.905、0.819、0.935、0.938。而茶褐素的含量在六堡茶渥堆过程中随着茶多酚含量的减少而增加，且呈现指数函数关系，并不呈现简单的线性关系，这可能因为茶褐素并不仅仅由茶多酚简单氧化、聚合而成，而是茶多酚及其氧化产物与氨基酸、糖类、没食子酸、咖啡因等物质反应生成[28]，空白样及添加纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和过氧化物酶试验样指数函数关系系数R2分别是0.932、0.890、0.813、0.948、0.910。

3 结论

六堡茶在渥堆过程，茶黄素含量比较稳定，茶红素含量逐渐减少，而茶褐素含量逐渐增加，（TF+TR）/TB的比值也呈现减少的趋势，即茶汤色泽逐渐加深。干茶的L和b值呈现先减小后增大再减小的趋势，a值逐渐增大。茶红素含量与茶多酚含量呈现正相关的线性关系，而茶褐素含量与茶多酚含量呈现指数函数的关系。在渥堆的某一阶段，果胶酶不仅可以提高茶叶中茶黄素、茶红素及茶褐素的含量，并且能促进茶汤色泽加深，纤维素酶可以降低茶红素转化为其他物质的速度从而提高茶红素含量，而木瓜蛋白酶可以增加茶褐素的含量及促进干茶色泽的加深，过氧化物酶在渥堆前期可以提高茶褐素的含量及促进干茶色泽转化。综上所述果胶酶、木瓜蛋白酶、过氧化物酶和纤维素酶在一定程度上能够提高茶汤中色素的含量或促进干茶色泽的转化，因此可以应用于六堡茶的渥堆工序中，进而达到缩短六堡茶渥堆时间和改善茶叶品质的目的。

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Effect of Exogenous Enzymes on the Change of Tea Pigments during Pile-fermentation Process of Liu Pao Tea

ZHANG Fen1，WEN Li-xiang1，HUANG Xin-xin1，PENG Jing-ru1，HE Mei-zhen2，LIN Jia-wei2，HUANG Shou-hui1，TAN Ye-wei1，HUANG Jun-da2
（1.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，Guangxi，China；2.Guangxi Wuzhou Tea Factory，Wuzhou 543002，Guangxi，China）

2017-03-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.014

广西壮族自治区亚热带作物研究所专项资金项目（桂热研201601）；广西壮族自治区科技专项（桂科AB 16380191）

张芬（1985—），女（汉），助理研究员，硕士研究生，研究方向：茶叶加工及茶树栽培育种。