荸荠皮多糖对自由基的清除作用

汪建红，吴维，韩平东

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川内江641112）

荸荠皮多糖对自由基的清除作用

汪建红1，2，吴维1，韩平东1

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川内江641112）

利用荸荠皮多糖为原料，分别对其对羟基自由基和超氧自由基的清除能力进行测定，并利用单因素试验和正交试验考察多糖质量浓度、温度和时间等因素对清除率的影响。结果表明，荸荠皮多糖清除羟基自由基的最佳条件为多糖质量浓度1.2 mg/mL、温度30℃、时间70 min，在此条件下对羟基自由基的清除率可达90.71%；荸荠皮多糖清除超氧自由基的最佳条件为多糖质量浓度1.2 mg/mL、温度25℃、时间10 min，在此条件下对超氧自由基的清除率可达56.64%。因此荸荠皮多糖对羟基自由基清除能力较强，对超氧自由基具有一定的清除能力。该研究为荸荠皮多糖的进一步开发利用提供理论基础和一定的参考价值。

荸荠皮多糖；羟基自由基；超氧自由基；清除率

Abstract：With polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel as raw materials，clearing ability of the polysaccharide for hydroxyl radicals and superoxide radicals，was determined，and influence of mass concentration of polysaccharide，temperature，and time，on clearing rate，were studied by single-factor experiments and orthogonal tests.The result showed that，the optimal conditions in which hydroxyl radicals were cleared by polysaccha ride in Eleocharis tuberosa peel，were mass concentration of polysaccharide of 1.2 mg/mL，temperature of 30 ℃，and time of 70 min，and under the optimal conditions，the clearing rate for hydroxyl radical could reach 90.71%.The optimal conditions in which superoxide radicals were cleared by polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel，were mass concentration of polysaccharide of 1.2 mg/mL，temperature of 25℃，and time of 10 min，and under the optimal conditions，the clearing rate for superoxide radicals could reach 56.64%.So，polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel had stronger clearing ability to hydroxyl radical，and certain clearing ability to superoxide radical.Theoretical basis and reference value were provided for further exploitation of polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel by the reaseach.

Key words：polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel；hydroxyl radical；superoxide radical；clearing rate

自由基是一类重要的氧化剂，人体的疲劳、衰老、疾病的产生，甚至肿瘤的产生都跟人体内自由基的作用有莫大的关系[1-6]。荸荠皮中含有丰富的植物多糖，具有消炎、抗肿瘤等生物活性，尤其还可清除体内大量的自由基，研究荸荠皮多糖对自由基的清除意义重大[7-10]。羟基自由基和超氧自由基是两种较为常见的自由基，本文选择提纯后的荸荠皮多糖，考察其对羟基自由基和超氧自由基的清除效果，并利用单因素试验和正交试验优化反应条件，为荸荠皮多糖的进一步开发利用提供理论基础。

1 仪器及试剂

1.1 试剂及原料

荸荠：四川内江农贸市场；乙酸钠、乙酸、乙醇、双氧水、邻菲罗啉、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、tris试剂、邻苯三酚（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器

T-6型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；7230G型可见分光光度计：上海洪纪仪器设备有限公司；DF-101S型磁力加热搅拌器：郑州英峪予华仪器有限公司；TDL-5-A型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；FA2204A型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；BSA822型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SHA-B型恒温水浴振荡器：金坛市汉康电子有限公司；DFT-100型手提式万能高速粉碎机：温岭市林大机械有限公司；SHB-B95型水循环多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；CS101-2AB型电热鼓风干燥箱：重庆试验设备厂；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

2 试验步骤

2.1 溶液的配制

分别配制0.75 mmol/L的邻二氮菲乙醇溶液、0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液、0.01%的双氧水、0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.2 mol/L的磷酸二氢钠溶液、0.05 mol/L的pH值为8.2的Tris-HCl缓冲溶液、25 mmol/L邻苯三酚溶液、8 mol/L的盐酸，并利用0.2 mol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液配制pH=7.4的缓冲溶液。

方法[11-12]提取、提纯荸荠皮多糖，并利用获得的荸荠皮多糖配制 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL的荸荠皮多糖溶液。

2.2 荸荠皮多糖对羟基自由基清除率测定

参考文献方法[13-16]，利用配制的0.75 mmol/L的邻二氮菲乙醇溶液、0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液、0.01%的双氧水和pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，在一定温度、时间和一定荸荠皮多糖质量浓度下分别测定A未损、A损和荸荠皮多糖的A样，荸荠皮多糖对羟基自由基的清除率按照如下公式计算：

式中：I为对羟基自由基的清除率，%；A损为损伤管中的吸光度值；A未损为未损伤管中的吸光度值；A样为荸荠皮多糖溶液管的吸光度值。

2.3 荸荠皮多糖对超氧自由基清除率测定

参考文献方法[17]，利用配制的0.05 mol/L的pH值为8.2的Tris-HCl缓冲溶液、25 mmol/L邻苯三酚溶液、8 mol/L的盐酸，在一定温度、时间和荸荠皮多糖质量浓度下分别测定A0和荸荠皮多糖的A1，荸荠皮多糖对超氧自由基的清除率按照如下公式计算：

式中：I为对超氧自由基的清除率，%；A0为空白对照的吸光度值，A1为荸荠皮多糖的吸光度值。

2.4 单因素试验和正交试验

2.4.1 清除羟基自由基的单因素试验和正交试验

单因素试验：在pH=7.4的条件下，选择不同荸荠皮多糖质量浓度（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL），不同温度（25、35、45 ℃）和不同时间（40、50、60、70、80 min），重复2.2的操作。

正交试验：根据单因素试验的结果，以多糖质量浓度、温度、时间为因素，每个因素3个水平，设计L9（33）正交表，并按照此表安排试验，重复2.2的操作。

2.4.2 清除超氧自由基的单因素试验和正交试验

单因素试验：在pH=8.2的条件下，选择不同荸荠皮多糖质量浓度（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL），不同温度（15、25、35、45、55 ℃）和不同时间（5、10、15、20 min），重复2.3的操作。

正交试验：根据单因素试验的结果，以多糖质量浓度、温度、时间为因素，每个因素3个水平，设计L9（33）正交表，并按照此表安排试验，重复2.3的操作。

2.5 对比试验

根据单因素试验和正交试验的结果，在相同条件下分别测定荸荠皮多糖、VC对羟基自由基和超氧自由基的清除率，重复2.2和2.3的操作。

3 结果与讨论

3.1 荸荠皮多糖清除羟基自由基的条件优化

3.1.1 荸荠皮多糖质量浓度的影响

荸荠皮多糖质量浓度对其对羟基自由基清除率的影响如图1所示。

从图1可看到荸荠皮多糖对羟基自由基的清除率随荸荠皮多糖质量浓度的增大而增大；当达到0.8 mg/mL时，清除率达到一个较大的值；此后，随质量浓度的继续增加，清除率没有明显变化。这是由于荸荠皮多糖质量浓度越大，与其反应的羟基自由基的量越大，则有越多的羟基自由基被清除，当达到0.8 mg/mL时，该反应已进行得较为充分，继续增加多糖质量浓度不但不会带来反应程度的明显变化，反而会造成荸荠皮多糖的浪费，因此综合考虑，选择最适宜的多糖质量浓度为0.8 mg/mL。

图1 多糖质量浓度对羟基自由基清除率的影响Fig.1 Influence of mass concentration of polysaccharide onclearing rate for hydroxyl radicals

3.1.2 温度的影响

温度对荸荠皮多糖对羟基自由基清除率的影响如图2所示。

图2 温度对羟基自由基清除率的影响Fig.2 Influence of temperature on clearing rate for hydroxyl radicals

从图2可看到，在25℃～45℃的范围内，随温度的上升，羟基自由基清除率先逐渐增加，后逐渐降低，当温度为35℃时达最大值。这是由于温度越高，分子运动越活跃，多糖越容易和羟基自由基反应，但温度过高时荸荠皮多糖会被氧化变质，硫酸亚铁和邻菲罗啉形成的有色络合物也会被空气中的氧氧化褪色，从对反应过程的观察也证实了这一点，在温度超过45℃继续升高时，反应体系颜色出现了从无色到砖红色，再到无色的变化。综合考虑，选择35℃作为反应温度。

3.1.3 时间的影响

时间对荸荠皮多糖对羟基自由基清除率的影响如图3所示。

从图3可看到，在40 min～80 min内，随着时间的延长，荸荠皮多糖对羟基自由基清除率先逐渐增加后逐渐降低。这是由于时间越长，荸荠皮多糖与羟基自由基的反应越充分，但时间过长时部分显色后的金属络合物也会被空气中的氧气氧化而颜色变浅。因此综合考虑选择最佳时间为60 min。

图3 时间对羟基自由基清除率的影响Fig.3 Influence of time on clearing rate for hydroxyl radicals

3.1.4 正交试验

以荸荠皮多糖质量浓度、温度和时间为因素的关于荸荠皮多糖对羟基自由基清除率的L9（33）正交试验结果、极差分析及方差分析结果如表1和表2所示。

表1 L9（33）正交试验设计及结果Table 1L9（33）orthogonal experimental design and results

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

从表1可看到，荸荠皮多糖清除羟基自由基的最佳条件组合为A3B1C3，即荸荠皮多糖质量浓度1.2 mg/mL，温度30℃，时间70 min，恰好是正交试验中试验7的条件。各因素影响的先后顺序为温度＞荸荠皮多糖质量浓度＞时间。

从表2的方差分析结果可看到，在所选择的正交试验的因素很水平范围内，因素A、B、C，即荸荠皮多糖质量浓度、温度和时间对羟基自由基清除效果的影响均未达到显著的水平。而F值结果表明，方差分析结果与极差分析结果一致。

为了验证正交试验结果作了3次平行试验，羟基自由基的清除率分别为85.25%、95.08%、91.80%，平均值90.71%，高于正交试验中除试验7之外的组合下的结果，说明正交试验结果的正确性。

3.2 荸荠皮多糖清除超氧自由基的条件优化

3.2.1 荸荠皮多糖质量浓度的影响

荸荠皮多糖质量浓度对其对超氧自由基清除率的影响如图4所示。

图4 多糖质量浓度对超过氧自由基清除率的影响Fig.4 Influence of mass concentration of polysaccharide on clearing rate for superoxide radicals

从图4可看到随多糖质量浓度的增加，荸荠皮多糖对超氧自由基的清除率先逐渐增加，当多糖质量浓度达到1.2 mg/mL后，清除率基本稳定，没有明显变化。这是由于开始时多糖质量浓度越大就有越多的多糖参与与超氧自由基的反应，因此有更高的清除率，当达到1.2 mg/mL后，荸荠皮多糖与超氧自由基的反应基本完成。因此，综合考虑对超氧自由基的清除率和节约资源，选择最适宜的多糖质量浓度为1.2 mg/mL。

3.2.2 温度的影响

温度对荸荠皮多糖对超氧自由基清除率的影响如图5所示。

从图5可看到，在15℃～55℃范围内，随着温度的升高，超氧自由基的清除率先逐渐增加后逐渐下降。这是由于温度的升高可导致分子运动更活跃，可使荸荠皮多糖在规定时间内与超氧自由基的反应更充分，但温度过高时会有部分荸荠皮多糖被空气中的氧气氧化变质，失去清除超氧自由基的能力，因此综合考虑选择最佳温度为25℃。

图5 温度对超氧自由基清除率的影响Fig.5 Influence of temperature on clearing rate for superoxide radicals

3.2.3 时间的影响

时间对荸荠皮多糖对超氧自由基清除率的影响如图6所示。

图6 时间对超氧自由基清除率的影响Fig.6 Influence of time on clearing rate for superoxide radicals

从图6可看到，随着时间的延长，超氧自由基清除率逐渐增加，当达到10 min后，继续延长时间没带来超氧自由基清除率的明显变化。这是由于反应刚开始时，反应程度较低，当达到10 min时，反应基本完成，继续延长时间不会带来反应程度的明显变化。因此综合考虑选择最适宜的反应时间为10 min。

3.2.4 正交试验

以荸荠皮多糖质量浓度、温度和时间为因素的关于荸荠皮多糖对超氧自由基清除率的L9（33）正交试验结果、极差分析及方差分析结果如表3和表4所示。

从表3可看到，荸荠皮多糖清除超氧自由基的最佳条件组合为A2B2C2，即荸荠皮多糖质量浓度1.2 mg/mL，温度25℃，时间10 min，非正交试验中的条件组合。

从表4的方差分析结果可看到，在所选择的正交试验的因素和水平范围内，因素A、B、C，即荸荠多糖质量浓度、温度和时间对超氧自由基清除效果的影响均未达到显著的水平。而F值结果表明，各因素影响的先后顺序为温度＞时间＞荸荠皮多糖质量浓度。

为了验证正交试验结果作了5次平行试验，超氧自由基的清除率分别为57.55%、57.56%56.02%、56.13%、55.93%，平均值56.64%，高于正交试验中最佳条件组合下的结果，说明正交试验结果的正确性。

表3 L9（33）正交试验设计及结果Table 3L9（33）orthogonal experimental design and results

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experiment results

3.3 对比试验

在质量浓度1.2 mg/mL、温度30℃、时间70 min的条件下，测定荸荠皮多糖和VC对羟基自由基的清除率，在质量浓度1.2 mg/mL、温度25℃、时间10 min的条件下，测定荸荠皮多糖和VC对超氧自由基的清除率，如表5所示。

表5 VC和荸荠皮多糖对羟基自由基和超氧自由基清除效果对比Table 5 Comparison of clearing effect VCand polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel for hydroxyl radicals and superoxide radicals

从表5可看到VC对羟基自由基和超氧自由基均表现出强大的清除能力，荸荠皮多糖对羟基自由基有较强的清除能力，而对超氧自由基具有一定的清除能力。

4 结论

通过单因素试验和正交试验可得出，荸荠皮多糖清除羟基自由基的最佳条件为多糖质量浓度1.2mg/mL、温度30℃、时间70 min，在此条件下对羟基自由基的清除率可达90.71%，表现出了较强的清除能力；荸荠皮多糖清除超氧自由基的最佳条件为多糖质量浓度1.2 mg/mL、温度25℃、时间10 min，在此条件下对超氧自由基的清除率可达56.64%，表现出了一定的清除能力。因此荸荠皮多糖确实是一种具有较强抗氧化性的物质，此试验为荸荠皮多糖的进一步开发利用提供了理论基础和一定的参考价值。

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Clearing Effect of Polysacchairde in Eleocharis tuberosa Peel on Radicals

WANG Jian-hong1，2，WU Wei1，HAN Ping-dong1
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641112，Sichuan，China；2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling in University of Sichuan，Neijiang 641112，Sichuan，China）

2017-01-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.003

四川省教育厅重点项目（15ZA0291）

汪建红（1981—），男（汉），高级试验师，硕士，主要从事天然产物的提取、纯化及性质等方面的研究。