毛细管电泳法同时测定发酵制品中D-和L-乳酸含量

汪雪莲，於钊庆，朱 莉，张裕铃，何 进

(华中农业大学生命科学技术学院，湖北 武汉 430070)

毛细管电泳法同时测定发酵制品中D-和L-乳酸含量

汪雪莲，於钊庆，朱 莉，张裕铃，何 进*

(华中农业大学生命科学技术学院，湖北 武汉 430070)

发酵制品中的乳酸通常是D,L-混合型，而D-乳酸的每日摄入量是有限制的。因此开发准确测定发酵制品中D-和L-乳酸含量方法，对于控制食品品质、保障食品安全具有重要意义。建立了同时测定发酵制品中D-和L-乳酸含量的毛细管电泳分析方法，考察了2-羟丙基-β-环糊精浓度、缓冲溶液pH值、分离电压、分离温度等因素对乳酸手性分离的影响。结果表明，使用中性毛细管，以500 mmol·L-12-羟丙基-β-环糊精为手性选择剂，200 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值为6.0)为电泳缓冲液，在分离电压为-20 kV、分离温度为20 ℃条件下可使D-和L-乳酸达到基线分离，分离度为1.5。

毛细管电泳；手性分离；乳酸；D-乳酸；L-乳酸

Abstract：Usually，both D- and L-lactic acids exist in the fermentation products.But D-lactic acid intake should be limited.So，developing an accurate method for the determination of D- and L-lactic acids in fermentation products is very important for controlling food quality and guaranteeing food security.We established a capillary electrophoresis assay for the simultaneous determination of D- and L-lactic acids in fermentation products,and investigated the effects of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin concentration，pH value of buffer solution，separation voltage，and separation temperature on the chiral separation of lactic acid.Results showed that D- and L-lactic acids reached the baseline separation，and the resolution was 1.5 under the conditions as follows: using neutral capillary,500 mmol·L-12-hydroxypropyl-β-cyclodextrin as a chiral selector， 200 mmol·L-1phosphate buffer (pH value 6.0) as electrophoretic buffer,separation voltage of -20 kV，and column temperature of 20 ℃.

Keywords：capillary electrophoresis；chiral separation；lactic acid；D-lactic acid；L-lactic acid

乳酸(lactic acid)又名α-羟基丙酸(α-hydroxypropionic acid)，为世界上公认的3大有机酸之一，广泛存在于生物体中，是生物细胞厌氧糖代谢的重要产物。乳酸是最小的手性分子，具有L(+)和D(-)2种对映体。许多乳酸菌细胞内表达乳酸消旋酶(lactate racemase)能催化L-或D-乳酸转化为相反的对映体。乳酸消旋酶的存在使得最终发酵产物仍为D，L-混合型乳酸[1]。

人和动物体内存在L-乳酸脱氢酶，能代谢L-乳酸，因而L-乳酸在食品工业上用作酸味剂和防腐剂，与柠檬酸、苹果酸等食用酸相比具有很强的竞争力。但是人和动物体内并不存在D-乳酸脱氢酶，不能分解与代谢D-乳酸[2]。因此摄入过量的D,L-乳酸或D-乳酸会导致血液中D-乳酸积累，引起代谢紊乱，甚至出现酸中毒症状[3-4]。世界卫生组织(WHO)明确规定人体每天的D-乳酸摄入量不能超过100 mg·kg-1，而对L-乳酸摄入量则不加限制[5]。

因此,乳酸制品中不仅需要测定乳酸总量，还需要准确测定D-和L-乳酸的含量，这对于控制食品品质、提高食品安全具有重要意义。利用乳酸脱氢酶的酶分析法是检测乳酸对映体的简单方法，但该方法反应时间长，误差也较大[6]。色谱是最常用的分离技术，已经建立了许多拆分乳酸对映体的HPLC[6-11]与GC[12-13]方法,但均需要专一性的手性色谱柱。毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)具有快速、高效、灵敏及对环境污染小等优点。已经有许多研究者建立了血液与体液中拆分乳酸对映体的CE方法[14-15]。鉴于此，作者针对发酵制品，优化并建立了分析D-和L-乳酸的CE分析方法，为发酵制品中D-乳酸的控制提供了一种简便方法。同时，该方法可为筛选高产L-乳酸的乳酸菌提供直接的鉴定方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

3种酸奶、1种泡菜，购于武汉市超市。

D-乳酸锂、L-乳酸锂，Sigma公司；2-羟丙基-β-环糊精，山东新大生物科技有限公司；乳酸(分析纯)、磷酸二氢钾、氢氧化钠、磷酸，国药集团化学试剂有限公司。

P/ACE MDQ型毛细管电泳仪、中性毛细管，Beckman Coulter 公司；S-320型pH计，Mettler Toledo公司；5415D型离心机，Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 毛细管电泳条件

在涂层的中性毛细管(60 cm×50 μm)中，以2-羟丙基-β-环糊精(500 mmol·L-1)为手性选择剂；检测波长为200 nm，分离电压为-20 kV，柱温为20 ℃；压力进样(0.5 psi × 40 s)；缓冲液经0.22 μm微孔滤膜过滤；每次运行前用双蒸水、1 mmol·L-1磷酸、双蒸水各洗5 min。

1.2.2 样品测定

配制80 mmol·L-1乳酸于-18 ℃保存，使用当天取出稀释10倍，离心(10 000×g、5 min)后加入样品管进行电泳。

酸奶、泡菜均稀释200倍，离心(10 000×g、5 min)后加入样品管进行电泳。

1.2.3 正交实验设计

在单因素实验基础上，为得到最佳的分离条件，设计正交实验如表1。

表1正交实验设计

Tab.1 Design of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 手性选择剂

环糊精及其衍生物是最为常用的手性选择剂[16]。本实验比较了不同环糊精的效果，结果表明，2-羟丙基-β-环糊精可以成功拆分乳酸对映体。这可能是由2-羟丙基-β-环糊精的特殊结构所决定的，其羟丙基上的羟基自由度较高，恰好能与乳酸的手性碳——羧基α-位碳原子很好地结合[17]。

2.2 分离电压、分离温度对手性拆分的影响

毛细管内的温度影响分离度。温度低，涡流或振动能减弱，从而增强D-或L-乳酸与2-羟丙基-β-环糊精内部和边缘的结合力，提高手性选择剂对对映体的选择性[18]。在17.5～30 kV电压范围内，分离度随着电压的升高而升高，当电压为20 kV时分离度达到最大，而后随着电压的升高分离效果反而变差，这可能与焦耳热有关。综合考虑，选择分离温度为20 ℃，分离电压为-20 kV。

2.3 正交实验结果

在9种电泳缓冲液中，5#缓冲液(即pH值为6.0，磷酸缓冲液浓度为200 mmol·L-1，2-羟丙基-β-环糊精浓度为500 mmol·L-1)的分离度最大(Rs=1.5)，已达基线分离(如图1)。而根据所得数据，用正交设计软件计算出的最优条件为：pH值6.0，磷酸缓冲液浓度225 mmol·L-1，2-羟丙基-β-环糊精浓度500 mmol·L-1。

进一步比较了这两种条件下的分离情况，结果表明5#缓冲液更利于分离。这说明考察的三因素之间可能还存在着交互作用，不能仅凭正交实验来确定最优条件。因此，确定以500 mmol·L-12-羟丙基-β-环糊精为手性选择剂，200 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值为6.0)为电泳缓冲液。

图1 乳酸的手性分离电泳图Fig.1 Chiral separation electrophoretogram of lactic acid

2.4 线性范围、检测限

配制浓度为0.1～10.0 mmol·L-1的乳酸系列标准溶液，在优化条件下进行电泳分离，以浓度为纵坐标、峰面积为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，线性关系见表2。

采用稀释法测得L-乳酸及D-乳酸的最低检测限分别为0.25 mmol·L-1和0.28 mmol·L-1。

2.5 重现性实验

以4 mmol·L-1乳酸溶液在优化条件下进行3次重复实验。结果表明，迁移时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别小于1.0%和2.0%，表明该方法重现性好。

2.6 回收率

将乳酸配制成1.59 mmol·L-1的溶液，分别与1 mmol·L-1D-乳酸(1#)和1 mmol·L-1L-乳酸(2#)及水(3#)以1∶1的比例混合，测定回收率，结果见表3。

表2方法的线性关系与检测限

Tab.2 Linear relationship and detection limit of the method

表3乳酸的回收率

Tab.3 Recovery of lactic acid

由表3可知，L-乳酸和D-乳酸的回收率分别为91.5%～106.3%和96.7%～108.8%，表明该方法准确度好。

2.7 样品的测定

在被测定的4种发酵制品中，只有酸奶C同时检测出L-乳酸和D-乳酸，其它发酵制品只检测出L-乳酸。根据回归方程，计算出4种发酵制品中L-乳酸含量分别为：酸奶A 112 mmol·L-1、酸奶B 122 mmol·L-1、酸奶C 114 mmol·L-1、泡菜36 mmol·L-1，其中酸奶C中D-乳酸含量为42 mmol·L-1。

3 结论

建立了乳酸对映体的手性拆分毛细管电泳法，并达到基线分离。L-乳酸在0.25～1.5 mmol·L-1、D-乳酸在0.28～1.4 mmol·L-1范围内线性关系好，重现性好、准确度高，而且简便易操作，能连续自动地进行发酵制品中D-乳酸和L-乳酸的测定。

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SimultaneousDeterminationofD-andL-LacticAcidsbyCapillaryElectrophoresis

WANG Xue-lian,YU Zhao-qing,ZHU Li,ZHANG Yu-ling,HE Jin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,HuanzhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

O657.8

A

1672-5425(2017)09-0064-03

中央高校基本科研业务费专项资金项目(HZAU：2662017PY112)

2017-06-13

汪雪莲(1986-)，女，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向：微生物学与生物信息学，E-mail:wangxuelian1215@163.com；通讯作者：何进，教授，E-mail:hejin@mail.hzau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.014

汪雪莲，於钊庆，朱莉,等.毛细管电泳法同时测定发酵制品中D-和L-乳酸含量[J].化学与生物工程，2017，34(9)：64-66,70.