林蛙皮的酶解工艺及抗氧化作用

刘同帅，李兴月，邱德亮，邱智东，翁丽丽

(长春中医药大学，长春 130117 )

林蛙皮的酶解工艺及抗氧化作用

刘同帅，李兴月，邱德亮，邱智东，翁丽丽*

(长春中医药大学，长春 130117 )

目的 优选林蛙皮酶解制备工艺，并研究其抗氧化作用。方法 采用酶解法，通过单因素考察试验和L9(34)正交实验，以水解度作为考察指标，对酶解工艺进行筛选；通过林蛙皮酶解液对羟基自由基，超氧阴离子及DPPH自由基的清除作用，研究其抗氧化能力。结果 林蛙皮的最佳酶解工艺为：料液比1：15，pH 6.5，中性蛋白酶加入量为3 000 U/g，45 ℃下水浴2 h， 90 ℃灭酶10 min，离心，得林蛙皮酶解液，此酶解液对羟基、超氧阴离子及DPPH自由基的清除率在一定范围内随浓度的升高而加强。结论 通过正交实验，得到中性蛋白酶酶解林蛙皮的最佳生产工艺，工艺合理可行，其酶解液具有良好的抗氧化活性，为林蛙皮进一步的化学及药理研究奠定了基础。

林蛙皮；酶解工艺；多肽；抗氧化

Abstract: Objective To optimize the enzymatic preparation process of Rana skin and study its anti-oxidize effect.Methods Take enzymatic method, use single factor experiment and L9(34) orthogonal experiment.Evaluating indicator is the degree of hydrolysis to screen enzymatic hydrolysis process; the scavenging activities of hydroxyl radical, superoxide anion and DPPH radical were studied by enzymatic hydrolyzate of Rana chensinensis.Results The optimal conditions of enzymatic hydrolysis process of rana skin were as follows： solid-liquid ratio 1：15, Ph6.5,neutral protease dosage of 3000U /g, at 45 ℃ water bath for 2 hours, 90 ℃ enzyme inactivation 10min, centrifugation and Rana skin hydrolyzate can be produced.The clearance of hydrolysis is enhanced with the the concentration of hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals in a certain range.Conclusion The optimum production process of neutral protease hydrolysis of Rana chensinensis was obtained through the orthogonal experiment.The process was reasonable and feasible.The hydrolyzate has good antioxidant activity and lays the foundation for further chemical and pharmacological studies.

Keywords: Rana skin; enzymatic hydrolysis; polypeptides; oxidation resistance

林蛙皮的主要成分是生物胺和生物活性肽，生物活性肽是当前医学、药学以及食品营养学界研究的热点之一，多肽不仅是蛋白质水解的中间产物，易于人体吸收，而且具有多种生物活性[1]。蛋白酶酶解法[2]制取多肽是一种较为普遍的方法，简便易行，产物分子量小，易被人体吸收，进入机体后没有有害物残留，安全性高。而多肽具有抗氧化、抗衰老作用，大多用于医学界和美容界，具有很好的临床效果。

1 材料

1.1 样品 林蛙皮。

1.2 试剂 木瓜蛋白酶（北京欣华绿源科技有限公司），中性蛋白酶（北京欣华绿源科技有限公司），胰蛋白酶（北京欣华绿源科技有限公司），甲醛溶液（西陇化工股份有限公司），氢氧化钠（片）（天津新通精细化工有限公司），七水合硫酸亚铁（西陇化工股份有限公司），双氧水（天津市光复科技发展有限公司），水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、抗坏血酸（光复精细化工研究所），1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（梯希爱上海化成工业发展有限公司），无水乙醇（北京化工厂），盐酸(北京化工厂），DPPH（美国Sigma公司）。1.3 仪器 雷磁pHB-4便携式pH计 (上海仪电科学仪器股份有限公司）， KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司），数显恒温水浴锅HH-S2（上海越众仪器设备有限公司），TU-1810PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 样品前预处理 林蛙皮置真空干燥箱内，烘干，粉碎。

2.2 酶解工艺研究

2.2.1 酶种类的优选 1）酶解液的制备 ： 精密称取5 g林蛙皮粉，加入适量蒸馏水，密封，超声20 min，调温，调pH值，加入一定量的酶，漩涡混匀 ，酶解过程保持pH值恒定，达到预定时间后，酶解结束，水浴灭酶，再将酶解液离心15 min，取上清液置于储液瓶中（4 ℃），待测定。用相同方法做空白对照。2） 蛋白质水解度测定方法：吸取15 mL水解液于250 mL烧杯中，加入去CO2蒸馏水60 mL，打开磁力搅拌器，采用0.05 mol/ L NaOH标准溶液调节pH值至8.20，停止搅拌，再加入10 mL新配制的20%中性甲醛溶液，摇匀，静置3 min，用0.05 mol/ L NaOH溶液滴定，直至溶液pH值至9.2，记录加入甲醛后消耗的NaOH溶液消耗量（mL）；同时做空白实验。 水解度计算公式参照文献[3-5]。记录试验过程中消耗的碱体积，可通过公式计算蛋白质的水解度。3）酶优选结果：分别取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，按照“2.2.1”项下方法对林蛙皮进行酶解并测定水解度，结果表明，3种酶水解度大小顺序为中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶，确定选用中性蛋白酶作为最佳水解酶。

2.2.2 中性蛋白酶酶解条件的优选[6]1）料液比对水解度的影响：在pH值6.5、温度为45 ℃、加酶量为2 000 U/g的条件下，水解2 h，料液比分别为1：10、1：15、1：20。按酶解液制备方法制备，依测定法测定，计算水解度。结果表明，中性蛋白酶最佳酶解料液比为1：15。2）加酶量对水解度的影响：在pH 6.5、温度为45 ℃、料液比为1：15的条件下水解2 h，加酶量分别2 000、3 000、4 000 U/g，按酶解液制备方法制备，依测定法测定，计算水解度。结果表明，加酶量为3 000 U/g时水解度最高。3）时间、温度、pH值对水解度的影响：根据文献检索及预实验的结果，选择pH值、温度、时间3个影响因素，每个因素选3个水平，以水解度为考察指标，选用L9（34）正交表进行实验，见表1。

表1 因素水平表

表1分析结果表明，各因素对试验结果影响的重要性依次为B＞C＞A，温度B、时间C有统计学意义，是主要影响因素；pH值A没有显著性，对试验结果影响最小，因为A没有显著性，综合选A1；结合生产实际，节约生产时间，综合评定确定各因素的最佳水平依次为： A因素的第1水平，B因素的第1水平，C因素的第2水平，即A1B1C2。即加15倍量的水，pH值6.5，温度45 ℃，加酶量3 000 U/g，酶解2 h。

2.3 抗氧化试验研究

2.3.1 样品溶液的制备 样品1：取林蛙皮60 g，加入中性蛋白酶，按照“2.2.1”项下方法制备。样品2：取林蛙皮60 g，除不加入中性蛋白酶外，其他按照“2.2.1”项下方法制备。

2.3.2 方法 1）林蛙皮酶解液对羟基自由基（- OH）的清除作用：根据Fenton反应[7]，在试管依次加入9 mmol/L水杨酸-乙醇2 mL, 9 mmol/L FeSO41 mL,加入不同浓度的待测样品溶液2 mL,再以8.8 mmol/L H2O2启动反应，37 ℃下反应0.5 h，以水作参比，在504 nm下测定加入样品后的吸光度，计算- OH清除率。2）林蛙皮酶解液对超氧阴离子（O2-）的清除作用：采用邻苯三酚自氧化法[8-9]，编号6只具塞试管，分别向10.0 mL具塞试管中加入Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，去离子水4.2 mL，混合均匀，25 ℃保温20 min，取出后加入邻苯三酚0.3 mL，分别加入不同浓度0.5、0.75 、1、1.5 、2.5 mg/mL的样品1 mL，混合均匀，水浴2 min， 320 nm处测定吸光度，每35 s记录1次。计算获得加不同浓度样品时邻苯三酚的自氧化速率。3）林蛙皮酶解液对DPPH自由基的清除作用[10]：精密量取样品溶液2 mL，置于具塞试管中，加入DPPH试液2 mL，混合均匀，置于暗处放置30 min，以蒸馏水为空白对照，于516 nm处测定吸光度值，平行测定3次。计算清除率。

2.3.3 结果 采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，采用t检验。

2.3.3.1 对羟基自由基（-OH）的清除作用 见表2。

表2 样品1及样品2对-OH清除率比较

2.3.3.2 林蛙皮酶解液对超氧阴离子（O2-）的清除作用 见表3。

表 3 样品1与样品2对O2-清除率的比较

2.3.3.3 林蛙皮酶解液对DPPH自由基的清除作用[11-13]见表4。

表4 样品对DPPH自由基的清除作用比较

3 小结

通过林蛙皮酶解工艺的研究，确定了林蛙皮的最佳酶解工艺条件为：原料经粉碎后，在pH值 6.5、料液比为1：15，温度为45 ℃条件下加入中性蛋白酶3 000 U/g，酶解2 h后， 90 ℃灭酶，离心，得酶解液。所得林蛙皮酶解液为林蛙皮的进一步的抗氧化研究奠定了基础。羟基自由基和超氧自由基是体内最主要的自由基和活性氧。其中，羟基自由基的化学性质活泼，同时也是毒性最大的自由基，可以与细胞内的各类有机物发生反应，造成脂质过氧化，蛋白质解聚与聚合，核酸断裂，多糖解聚的重要活性氧，是反应物质抗氧化作用的重要指标。由本文可知，林蛙皮在酶解前后均具有一定的自由基清除能力，并且在一定范围内随着浓度的增大清除率逐渐增强。但林蛙皮酶解后的清除率大于酶解前的林蛙皮清除率，说明林蛙皮经酶解后在体外抗氧化活性增强，本实验结果为林蛙皮的后期实验研究奠定了良好的基础，使林蛙皮这一资源得到充分有效利用，变废为宝。

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Study on enzymatic hydrolysis process of Rana skin and antioxidant activity

LIU Tongshuai, LI Xingyue, QIU Deliang, QIU Zhidong, WENG Lili*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R283.6

A

2095-6258(2017)05-0717-03

2017-01-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.010

吉林省科技发展计划项目（20150309009YY）。

刘同帅（1991 -），女，硕士研究生，主要从事中药学方向研究。

*通信作者：翁丽丽，电话-13039218920，电子信箱- 735110462@qq.com